Tiobarbitürik Asit Reaktif Maddeler Tahlil kullanılarak Biyolojik Örneklerde Oksidatif Stresin Değerlendirilmesi

Bu nedenle, TBARS testi, biyolojik numunelerdeki oksidatif stresin laboratuvar içi genel değerlendirmesi için en iyi şekilde kullanılır, burada nispi TBARS seviyeleri, birlikte depolanan ve işlenen numuneler arasında doğrudan karşılaştırılır. Bu tahliller, yaklaşık 400'e mal olan ticari olarak mevcut kitlere kıyasla 96 numuneyi test etmek için yaklaşık 3 gibi son derece düşük bir maliyete sahiptir ve yalnızca tek bir parti numunenin analiz edilmesine izin verir. Burada açıklanan yöntem, biyolojik numuneler, stabilite çalışmaları ve analizden önce antioksidanların veya diğer numune koruyucularının eklenmesinin uygun veya zorunlu olduğu uygulamalar dahil olmak üzere spesifik uygulamalar için daha fazla uyarlanabilir.

Çok değişken sonuçlardan kaçınmak için, renk reaktifleri için pH'ın dörtten büyük olmadığından emin olarak taze reaktifler hazırlayın ve emilimi ölçmeden önce nidese şişme plakasındaki kabarcıkları çıkarın. % 0.8 sulu bir tiyobarbitürik asit çözeltisi hazırlayarak başlayın. Dört gram sodyum hidroksit boncuğunu 20 mililitre suda çözerek beş molar sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın.

Çözeltiyi plastik bir kapta saklayın. Her parti için taze olarak hazırlanmalıdır. 450 mililitre deiyonize suya dört gram tiyobarbitürik asit ekleyin ve nazikçe çözmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın.

100 mikrolitrelik artışlarla yaklaşık dört mililitre sodyum hidroksit çözeltisi yavaşça ekleyin ve tiyobarbitürik asit parçacıkları çözüldükçe pH'ı kontrol edin. Tüm parçacıklar çözülene kadar sodyum hidroksit eklemeye devam edin. Çözeltinin pH'ının bir pH şeridi ile dörtten yüksek olmadığını doğrulayın, ardından son hacmi deiyonize su ile 500 mililitreye getirin ve sulu tiyobarbitürik barbarik asit çözeltisini oda sıcaklığında saklayın.

İki mililitrelik geçmeli kapaklı polipropilen tüplerde MDA bis dimetil asetal standart eğri çözeltileri hazırlayın. 200 mikromolar stok çözeltisini metin el yazmasında anlatıldığı gibi suda seyrelterek. Örnekleri girdaplayın.

Analiz edilecek numuneler için cam tüpleri etiketleyin, ardından hazırlanan numuneden her tüpe 100 mikrolitre ekleyin. Her numuneye 200 mikrolitre %8,1 SDS ekleyin ve karıştırmak için cam tüpü dairesel hareketlerle hafifçe döndürün. Her numuneye 1,5 mililitre 3,5 molar sodyum asetat tamponu ekleyin, ardından 1,5 mililitre sulu %0,8 tiyobarbitürik asit çözeltisi ekleyin.

700 mikrolitre deiyonize su ekleyerek her tüpteki finali dört mililitreye getirin. Cam tüpleri sıkıca kapatın ve bir saat boyunca 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Yoğuşmayı önlemek için tüpleri alüminyum folyo ile örtün, ardından tüpleri bloktan çıkarın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneleri ve standartları dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüjleyin. Her tüpten 150 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve pipet ucuyla hava kabarcıklarını giderin. Numunelerin absorbansını 532 nanometrede ölçün, ardından boş numunelerin ortalama emici okumasını diğer tüm emici okumalarından çıkarın.

Standart bir eğri oluşturun ve bunu bilinmeyen numune konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanın. Üç farklı biyolojik numunede testin tespit ve duyarlılık sınırlarını ve oksidasyon seviyelerini belirlemek için MDA bis dimetil asetol standart eğrileri oluşturulmuştur. Üç numune üzerinde farklı günlerde toplam 9 TBARS testi yapıldı.

Tespit sınırlarını belirlemek için, boş numunelerin absorbansı üç farklı günde ölçüldü. Algılanabilir bir gürültü emici olmayan sinyal vermek için gereken minimum TBARS madde konsantrasyonu 1.1 mikromolardır. Ve tahlilin hassasiyeti, konsantrasyondaki mikromolar artış başına yaklaşık 0.0016 emici birimdir.

TBARS testi, çeşitli biyolojik matrislerin lipid peroksidasyonundaki değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir. Bunu göstermek için, insan serumu HEPG2 hücre lizatlarının ve düşük yoğunluklu lipoproteinlerin invitro oksidasyonunu indüklemek için iki bakır klorür kullanıldı. EDTA içeren LDL numuneleri üzerinde bir TBARS testi yapıldı ve bakır iki muamele edilmiş ve muamele edilmemiş LDL numunesi arasında TBARS seviyeleri değişmedi.

Bununla birlikte, EDTA spin filtrasyonu ile uzaklaştırıldıktan sonra, LDL'ye bakır iki aracılı oksidasyon uygulandı. İnsan serumundaki TBARS testinin dinamik aralığını göstermek için, numunelere iki milimolar bakır iki iyon konsantrasyonu eklendi ve bu da TBARS'ta altı ila yedi kat artışa neden oldu. Bu protokolü denerken, numuneleri 10 dakikadan daha uzun süre buz üzerinde bırakmayın ve santrifüjlemeden sonra oda sıcaklığında bırakın.

Başlangıçta toplanmayan, işlenmemiş ve birlikte saklanmayan biyoörneklerin partileri veya alt kümeleri için, artefakt oksidasyonun sonuçlara katkıda bulunmadığından emin olmak için parti etkileri için veriler istatistiksel olarak değerlendirilmelidir. Düşük yoğunluklu lipoproteinden kasıtlı olarak ölçülebilir invitro oksidasyon, oksidasyonun işleyiş biyolojisini nasıl etkilediğini anlamayı mümkün kılar.