İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Bu deneyin genel amacı, pseudomona siro PV tomato'nun domates bitkilerindeki redoks düzenlemeli proteinler üzerindeki etkilerini gözlemlemektir. Öncelikle, patojen enfeksiyonunu ve protein yanıtını tetiklemek için domates bitkileri pseudomona siro PV PV tomato ile inoküle edin. Reaktif oksijen türlerindeki değişimleri gözlemlemek için DIAM benzin ile boyama işlemine geçin.

Ardından, proteinlerdeki redoks regüleli sisteinleri incelemek için sist TMT etiketlemesi gerçekleştirin. Elde edilen sonuçlar, işlem görmüş ve kontrol örnekleri arasındaki değişimleri ölçebilir. Merhaba, ben Florida Üniversitesi Biyoloji Bölümü ve Proteomik Tesisi'nden Chen.

CTMT etiketleme yöntemimizin, ASCA olarak da bilinen izotop kaplı fin etiket gibi mevcut yöntemlere göre avantajı, geniş ölçekte redoks duyarlı proteinleri analiz ederken aynı anda birden fazla örneğin analiz edilebilme (multipleksleme) yeteneğidir. Bu çalışma, patojen enfeksiyonuna yanıt olarak domatesin redoks düzenlemeli proteinleri hakkında içgörü sağlayacak olsa da; deney, meyve sinekleri, fareler ve diğer bitkiler gibi diğer sistemlere ve stres koşullarının kontrolüne de uygulanabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak, yalnızca iki etiketin mevcut olması nedeniyle ICAD deneyleri arasında belirgin varyasyonlar gözlemledikten sonra ortaya çıkmıştır.

Etiketleme ve zenginleştirme basamaklarının öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin VIR gösterimi kritik öneme sahiptir. Etiketli numuneler arasındaki deneysel varyasyonlar minimize edilmeli ve etkili etiketleme sağlamak için çıkarılan bölgeler azaltılmalıdır. Hadi başlayalım. İnokülüm kültürü için dört inç çapındaki saksılarda benzer boyutta iki adet transplant edilmiş domates fidesi yetiştirin.

KBM plakası üzerinde Pseudomonas syringae çimlenmesi. Bakterileri 20 mililitre suya sıyırın ve mililitrede yaklaşık 10⁶ koloni oluşturan birim değerinde bir bakteri inokülumu hazırlayın. Bir litre inokülasyon tamponu içerisinde, dört haftalık bitkileri 30 saniye boyunca bakteriyel inokülasyon çözeltisine daldırın.

Ardından hemen şeffaf plastik torbalarla kapatın. Tercih edilen inokülasyon süresinden sonra, tamamen genişlemiş yaprağı hasat edin ve epiderm tabakası yukarı gelecek şekilde 1 mg/mL DAB boyasına yerleştirip 15 dakika boyunca vakum infiltrasyonuna tabi tutun. Daha sonra yaprakları oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca inkübe edin.

Şimdi, boyanmış yaprakları 10 dakika boyunca %95 etanolde kaynatın ve bir havan yardımıyla öğüterek %75 etanolda saklayın. Hasat edilen yaprakları sıvı azot içerisinde ince bir toz haline getirin. Ardından, beraberindeki metinde açıklandığı şekilde fenol ekstraksiyonlarını gerçekleştirin.

Ardından, fenol ile ekstrakte edilen proteinleri, %100 metanol içinde beş hacim soğuk 0,1 molar amonyum asetat ile çöktürün. Proteinleri santrifüjle toplayın ve pelet yıkamalarını gerçekleştirin. Daha sonra örnekleri 1,5 mililitre soğuk, %70 etanol içinde yeniden süspande edin ve iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Santrifüjden sonra, etanol süpernatantını dökün ve pelletini bir speed vac cihazında kısa süreliğine kurutun. Santrifüjle bir pellet oluşturduktan sonra örnekleri denatüre eden bir protein ekstraksiyon tamponunda çözün, süpernatantı toplayın ve üretici kılavuzuna göre protein konsantrasyonunu ölçün. Altı kütle etiketi (mass tag) için, serbest tiyol gruplarını bloke etmek amacıyla, eşit hacimdeki taze hazırlanmış 200 millimolar IO asetamid alkilasyon tamponu ile birlikte her bir protein örneğinden 100 micrograms ile başlayın ve 37 degrees Celsius'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, proteinleri çöktürmek için bir milliliter soğuk %80 aseton ekleyin ve gece boyunca minus 20 degrees Celsius'de bekletin.

Proteini santrifüjle çöktürün ve %80 asetona ile üç kez yıkayın. Numuneleri buz üzerinde hava ile kuruttuktan sonra, çökeleği 50 microliter liziz tamponunda tekrar süspande edin. Ardından, disülfür bağlarını azaltmak için 0.5 microliter 100 millimolar TCEP ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Reaktif tüplerine 20 µL asetonitril ekleyerek etiketleri çözünür hale getirin. Vorteksleyin ve çöktürmek için santrifüjleyin. Fazla TCEP'yi uzaklaştırmak için, bir MicroCon 3 KD kolonuna 50 µL örnek yükleyin. 50 µL lizis tamponu ekleyin ve 4 °C'de, 10.000 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Numuneyi toplamak için kolonu çıkarıp temiz bir tüpün içine ters çevirin ve santrifüjleyin. Gerekiyorsa numunenin pH değerini kontrol edin. Bir molar hidroklorik asit ile pH değerini yedi ile sekiz arasına ayarlayın.

Kist TMT reaktifinden beş mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin, örnekleri birleştirin ve eşit hacimde laly örnek tamponu ekleyip beş dakika kaynatın ve önceden dökülmüş %12'lik poliakrilamid jelde ayırın; jeli filtrelenmiş suyla üç kez duruladıktan sonra bir saat boyunca Coomassie blue ile boyayın ve protein bant konsantrasyonlarına göre suda gece boyunca duyarsızlaştırın. Her jel şeridini 12 fraksiyona ayırın. Her fraksiyonu bir milimetrelik parçalara bölün ve 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin.

Jel parçalarını %50 asetonitril içeren 0,1 molar amonyum bikarbonat içerisinde tamamen bekletin. Ardından parçaları 15 dakika boyunca %100 asetonitril ile kaplayın. Sıvıyı uzaklaştırın ve parçaları speed vac kullanarak kurutun.

Ardından, eşit hacimde tripsin çözeltisi ekleyin ve rehidratasyon için buza yerleştirin. Daha sonra, tripsin sindirimi için 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, inkübe edilen örneklerden sıvı protein ekstraktını uzaklaştırın.

Jel parçalarını %5 formik asit ve %50 asetonitril ile kaplayarak reaksiyonu durdurun ve kalan protein sindirimini uzaklaştırın. Ardından jel parçalarını oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sallayın. İki ekstraksiyon daha yaptıktan sonra süpernatanı ekstrakte edilen protein örnek tüplerine aktarın.

Numuneleri 0,5 mililitrelik tüpler içinde vakumlu santrifüjle (speed vac) kurutun. İlgili protein bandının yoğunluğuyla orantılı bir konsantrasyonda, TBS içinde %50'lik anti-TMT reçine süspansiyonu hazırlayın. Reçineyi, bir kolon hacmi kadar bir kat TBS ile üç kez yıkayın, ardından her bir numuneye 200 mikrolitre TBS ekleyin.

Ardından anti-TMT reçinesine aktarın ve oda sıcaklığında iki saat boyunca ajite edin, ardından dört santigrat derece sıcaklıkta gece boyunca sallayarak inkübe edin. Her bir örneği bir kolona yükleyin. Her biri 200 µL olan kolon yıkamalarını gerçekleştirin.

Ardından, her örneği üç kez 200 µL %50 elüsyon tamponu ile elüe edin ve vakum altında kurutun. Örnekleri 0,1% formik asit içeren 12 µL %3 asetonitril içinde süspanse edin ve beş µL'sini doğrudan bir HPLC kolonuna enjekte edin. Peptitleri, ekteki metinde ayrıntıları verilen artan asetonitril gradyanı kullanarak elüe edin.

İki çarpı üç iş akışında peptidleri tespit etmek için kütle spektrometrisi kullanın. Tek aşamalı ms ile başlayın. Ardından, üç adet yüksek enerjili C-tuzağı ayrışma fragmantasyonu ile takip edilen üç Ms.Ms spektrumu edinin.

Protein tanımlama için çarpışma ile indüklenmiş ayrışmalı Ms.MS. Kütle spektrometri verilerini dallanmış bir iş akışı kullanarak analiz edin. Oranı nicelleştirmek için bir raporlayıcı demir nicelleştirici uygulayın.

Ayrıca, MSM MS spektrumunu spektrum seçici, spektrum normalleştirici ve spektrum gruplayıcı düğümler aracılığıyla işleyin ve verileri seaquest arama motoruna karşı sorgulayın. Bu görüntü, yapraklar DAB kullanılarak boyandıktan sonra sol tarafta kontrol grubu bir domates bitkisi yaprağına ve sağ tarafta pseudomonas inoküle edilmiş bir yaprağa örnekler göstermektedir. DES boyama işlemi, histokimyasal boyamanın yaprak dokusundaki reaktif oksijen türleri belirtilerini göstermesine olanak tanır.

Beklendiği üzere, kontrol grubu herhangi bir belirgin boyanma göstermezken, Pseudomonas ile işlem görmüş yapraklar hidrojen peroksit üretimi için pozitif boyanma göstermektedir. Bu örnek, proteom keşif veri çıktısını göstermektedir; her numune için diferansiyel redoks regülasyonuna uğramış bir proteinin pik alanı, mutlak kantifikasyona olanak tanır. Kontrol ve inoküle edilmiş numuneler arasındaki pik alanı, bağıl miktarları belirtir.

Burada, bir kontrol ve inoküle edilmiş örnek arasındaki bir proteinin redoks düzenlemesi benzerdir. Benzer yoğunluktaki pikler, işlem değişikliği ile düzenlenmeyen disülfit bağlarının varlığına işaret eder. Bu teknik bir kez kavrandığında, bir hafta içinde uygun şekilde uygulanabilir.

Numunelerin soğuk tutulmasını ve etiketlerin düzenli olmasını unutmayın. Ayrıca, bu prosedürü takip ederek çeker ocakta çalışmak ve uygun eldivenler kullanmak gibi fenol kullanımı sırasında önlemler alın.

Bu videoyu izledikten sonra, DIB standing CTMD etkinleştirme ve redox 16 kalifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.