Çift Marker (MADM) ile Mozaik Analizi Kullanarak Serebral Korteks Geliştirilmesinde Soy İzleme ve Klonal Analizi
8 Mayıs 2020
Çift belirteçli (MADM) ile mozaik analizi kullanılarak aday genlerin tek bir hücre düzeyinde soy izleme ve fonksiyonel genetik analizini yapmak için bir protokol sunulmuştur. MADM klonal analizi, bireysel ataların ve kız hücrelerinin proliferatif davranışını, hücresel çıktısını ve soy ilişkisini ölçmek için nicel bir çerçeve sağlar.
Çift Marker teknolojisi ile Mozaik Analizi bireylerin kök hücrelerinin çoğalma davranışı ve mahzen çıkışları hakkında son derece nicel bilgi sağlayabilen güçlü bir yöntemdir. Bu tekniğin eşsiz bir özelliği, tek hücre düzeyinde aday genlerin soy izleme ve fonksiyonel genetik analizizin izin verilmesidir.prosedüre demontrating, Carmen Streicher, teknisyen, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc ve Andy Hansen, benim laboratuvar bir doktora öğrencisi olacaktır. Deneysel Farelerde MADM rekombinasyon olaylarını indüklemek için, gebe barajına zamanlanmış bir tamoksifen intraperitoneal enjeksiyonu yapmak için 25 gauge iğne ile donatılmış 1ml'lik bir şırınga kullanın. MADM klonal analizinden doğum sonrası zaman noktalarına kadar. Embriyonik günlerde 18-19, supine pozisyonda hamile bir fare yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk dezenfekte. Rahim üzerinde alt karın deride küçük bir kesi yapmak ve periton ortaya çıkarmak için kaslar ve karın kas duvarı ile ikinci bir kesi yapmak. Rahimi çevre dokulardan ayırmak için makas kullanın ve bozulmamış rahmi ılık suyla bir eldivene yerleştirin. Sonra dikkatle embriyolar serbest bırakmak için rahim duvarları açmak için ince ucu makası ve parmakkullanın. Doğum öncesi hayvanları koruyucu anneye aktarmadan önce nefes almaya başlamak için zaman zaman göğüslerine hafifçe basan yavruları temizleyin. Nöral MADM Klon Doku toplamak için bir perfüzyon ameliyat tepsisi üzerinde supine pozisyonda anestezi li bir hayvan yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk dezenfekte. Kas tabakası ile deri ve bir kesi ile bir kesi yapmak için makas ve forceps kullanın. Torasik kavite görünür olduğunda, kalbi ortaya çıkarmak için diyaframı koklayın ve kaldırın ve göğüs kafesini dikkatlice kırpın ve cerrahi tepsiye sabitleyin.PBS ile dolu bir iğneyi kalbin sol alt ventrikülüne bağlayın ve sağ atriumun arka ucunda bir kesi yapmak için küçük İris makasları kullanın. Kardiyovasküler sistemi PBS ile perfüzyon ve hemen ardından pbs'de taze hazırlanmış buz soğuk %4 paraformaldehit ile perfüzyon yapın. Perfüzyon tamamlandığında, dikkatli diseksiyonu ile beyin çıkarın ve en az beş kez taze% 4 paraformaldehit beyin hacmi 4 gecede hasat organ yerleştirin
Genel Bakış
Bu çalışma, Çift İşaretleyicili Mozaik Analiz (MADM) kullanarak, tek hücre düzeyinde aday genlerin soy takibi ve fonksiyonel genetik analizi için bir protokol sunmaktadır. MADM klonal analizi, münferit progenitörlerin ve onlardan türeyen hücrelerin proliferatif davranışlarının ve hücresel çıktılarının kantitatif olarak ölçülmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Soy hattı takibi
- Genetik analiz
- Kök hücre biyolojisi
Arka Plan
- MADM teknolojisi, hücre proliferasyonunun anlaşılmasında temel bir rol oynamaktadır.
- Bu yöntem, tek hücre düzeyinde izleme yapılmasına olanak sağlar.
- Uygulamalar arasında hücresel çıktıların ve soy ilişkilerinin değerlendirilmesi yer almaktadır.
Kullanılan Yöntemler
- Çift Markörlü Mozaik Analizi (MADM)
- Deneysel model: Fareler
- Teknikler arasında intraperitonal enjeksiyonlar ve doku perfüzyonu yer almaktadır.
Temel Sonuçlar
- Progenitör davranışlarının ayrıntılı olarak incelenmesine olanak sağladı.
- Yavru hücrelerin soy hatları arasındaki ilişkilere dair içgörüler sundu.
- Fonksiyonel genetik analiz için güvenilir bir yöntem ortaya koydu.
Sonuçlar
- Bu çalışma, genetik analizlerde MADM kullanımı için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.
- Bulgular, gelişim biyolojisi alanına önemli katkılar sağlamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel İlgi
Çift Markerlı Mozaik Analizi (MADM), gelişmekte olan serebral kortekste benzeri görülmemiş tek hücre çözünürlüğünde soy takibi ve klonal analiz imkanı sunarak, nöral kök hücre kaderinin ve bölünme modellerinin haritalanması zorluğunu doğrudan ele alır. Bu yetenek, erken nörogelişimsel hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve MSS portföy kararları için mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. MADM'nin kantitatif ve kalitatif çıktıları, onu nörobiyoloji odaklı Ar-Ge boru hatlarında fonksiyonel genetik inceleme için kritik bir araç konumuna getirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Nöral kök hücre soy hattı geçişlerinin ve bölünme modlarının hassas bir şekilde sorgulanmasını sağlar.
- Nörogelişimsel yolaklardaki aday genlerin fonksiyonel doğrulamasını destekler.
- Kontrol ve mutant altklonları in vivo olarak ayırt ederek mekanistik risk azaltma sağlar.
- MSS terapötik programları için yüksek güvenilirlikli hedef seçimini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt akıştaki fenotipik taramalar için doğrulanmış tek hücreli soy haritaları oluşturur.
- Progenitör proliferasyonu ve kader belirlemesinin tekrarlanabilir, kantitatif okumalarını sağlar.
- Aynı doku ortamı içinde karşılaştırmalı analize olanak tanıyarak assay standardizasyonunu destekler.
- Nörogelişimsel bağlamlarda bileşik değerlendirmesi için sağlam biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Soy hattı izleme çıktılarını, hastalıkla ilişkili nöral devre oluşumu ile ilişkilendirir.
- Keşif aşamasındaki genetik manipülasyondan preklinik model doğrulamasına kadar olan sürekliliği sağlar.
- In vivo fonksiyonel kanıtlara dayanarak MSS hedeflerinin riskle ayarlanmış ilerlemesini destekler.
- Nöral progenitörlerin klonal analizi yoluyla translasyonel biyobelirteç içgörüleri sağlar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
MADM tabanlı soy takibi, MSS odaklı süreçlerde erken keşiften öncü madde tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar olan tüm aşamaları entegre eder.
- Keşif Biyolojisi: Nöral kök hücre kaderi ve bölünme modelleri için yüksek çözünürlüklü hipotez testleri sunar.
- Tarama: Analiz geliştirme ve bileşik tarama için kantitatif, tekrarlanabilir soy hattı verileri sağlar.
- Analitikler: Kontrol ve mutant progenitör davranışlarını karşılaştırmak için optik ve istatistiksel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Soy hattı sonuçlarını in vivo olarak haritalandırarak keşif bulgularını preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Uygun CreERT2 sürücüleri ile herhangi bir murine kök hücre nişine uyarlanabilir ve platform ölçeklenebilirliğini destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sinirsel soy çalışmalarında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik için soy takibi ve klonal analiz iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Devam/tamam kararlarını bilgilendirir ve MSS portföylerindeki geç aşama biyolojik riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: in vivo fonksiyonel verilere dayanarak nörogelişimsel hedeflerin riskle ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Genetik manipülasyon, in vivo soy takibi ve nöroanatomik diseksiyon konularında uzmanlık gerektirir.
- CreERT2 sürücülerine sahip fare modellerine ve gelişmiş görüntüleme altyapısına erişim gerektirir.
- Tekrarlanabilir klonal analiz ve veri yorumlaması için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Uygun genetik sürücüler ve doku işleme protokolleri ile çeşitli kök hücre nişlerine uyarlanabilir.
- Genetik araçların ve doku erişiminin mümkün olduğu fare sistemleriyle sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
