İnsan Böbrek Dokusunda Bölgesel TranskriptomikLeri Ortaya Çıkarmak İçin Lazer Mikrodispeksiyon Uygulaması
9 Haziran 2020
Glomerulus, proksimal tübül, kalın yükselen uzuv, toplama kanalı ve interstiyum dahil olmak üzere insan böbreğinin alt segmentlerinin lazer mikroseksiyonu için bir protokol açıklıyoruz. RNA daha sonra elde edilen bölmelerden izole edilir ve her alt segmentteki transkriptomik imzadaki değişiklikleri belirlemek için RNA dizilimi gerçekleştirilir.
Lazer mikrodiseksiyon, böbrek dokusu örnekleri içinde mekansal olarak tanımlanmış bölgelerin transkriptomik analizine izin verir. Bu bize, hastalık kaynaklı değişiklikler meydana geldikten sonra bile ilgilenilen yapıları tanımlamak için eşsiz bir fırsat sağlar. Bu metodolojinin temel avantajları, tek hücreli RNA dizilimi gibi diğer omik teknolojilere tamamlayıcılığıdır.
Dikkate değer bir doku ekonomisi sağlar ve hatta düşük ifade edilen transkriptlerin tespit edilmesine izin verir. Doku örneğini aldıktan sonra, örneği 12 mikrometre kalınlığa kadar kesmek için eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat kullanın ve örneği özel bir lazer mikrodiseksiyon slaydına sabitlemek için kayar adaptörü kullanın. Kriyoseksiyondan sonraki 10 gün içinde, PBS'de 89.2 mikrolitre RNaz içermeyen% 10 BSA'yı dört mikrolitre FITC phalloidin, 1.5 mikrolitre DAPI, iki mikrolitre doğrudan Alexa Fluor 546'ya konjuge edilmiş ilgili antikor ve 3.3 mikrolitre RNase inhibitörü ile karıştırın.
Slaytı eksi 20 santigrat derece %100 asetonda bir dakika yıkayın ve slaytı bir nem odasına yerleştirin. Sürgünün üst kısmını, yıkama başına 30 saniye boyunca taze RNaz içermeyen PBS ile iki kez yıkayın, ardından RNaz içermeyen PBS'de %10 BSA ile 30 saniyelik iki yıkama yapın. Son yıkamadan sonra, RNaz içermeyen PBS'de% 10 BSA ile iki kez daha yıkamadan önce numuneyi hazırlanan antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında beş dakika
tedavi edin.İkinci yıkamadan sonra, slaytı lazer mikrodiseksiyon kesme platformuna yüklemeden önce slaytı bir doku kültürü başlığında beş dakika havayla kurutun. Bir RNA izolasyon kitinden 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu içeren, PCR çalışmasına uygun, otoklavlanmış 500 mikrolitrelik mikro santrifüj toplama tüplerini cihaza takın. Yüklemeden sonra, numune içindeki ilgili bölgeleri boyama, morfoloji ve konuma göre belirleyin.
İlgilenilen en az 500.000 mikrometre karelik segmentleri özetlemek için immünofloresan kullanın. Ardından, 40'tan büyük bir lazer gücü kullanarak bölgeyi eksize etmek için lazer mikrodiseksiyonunu başlatın. Lazer mikrodiseksiyon işleminin tamamlanmasının ardından, mikrosantrifüj toplama tüplerini kapatın ve içeriğin kapaklardan tüplerin dibine doğru hareket etmesini sağlamak için tüpleri kuvvetlice hafifçe vurun.
Santrifüjlemeden sonra, tüpleri tekrar santrifüjlemeden önce tüpleri 42 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Daha sonra süpernatanları eksi 80 santigrat derece depodan yeni 500 mikrolitrelik tüplere aktarın. Böbrekteki tübüler alt segmentlerin tanımlanması, hücre morfolojisi ve yapısal işaretlere ek olarak benzersiz tübüler belirteçlerin antikor boyaması ile gerçekleştirilir.
Morfolojik doku özellikleri ve görüntü yapılarının uzamsal konumlandırılması ile bağlantılı olarak floresan etiketleme, böbrek alt segmentlerinin yüksek derecede güvenle görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu temsili aşağı akış dizileme analizinde, minimum diseksiyon alanı girdisini karşılamanın başarı oranı %90'dan fazlaydı ve bu da gen tespiti için mevcut olan yüksek bir toplam mRNA miktarı ile sonuçlandı. Bu analizde, örneklerin% 100'ü en az 10.000 genin minimum tespit eşiğini karşıladı.
Lazer mikrodiseksiyondan sonra, bilinen belirteçlerin gen ekspresyonunun zenginleştirme analizi, diğer bölmelerden gelenlerle karşılaştırılabilir. Bu analizde, lazer mikrodiseksiyon bölgesel transkriptomikleri ile her bir alt segment için bir belirteç tanımlandı ve bu da karşılık gelen nefron alt segmentinin spesifik bir immünohistokimyasal boyamasını verdi. Lazer mikrodiseksiyonun, diseke edilecek ilgili yapıları kesin olarak tanımlamak için büyük ölçüde kullanıcının uzmanlığına dayandığına dikkat etmek önemlidir.
Bu teknik, sağlıklı dokunun biyolojisinin yanı sıra hastalığın ilerlemesinde rol oynayan potansiyel yolları değerlendirmek için kullanılabilecek spesifik bölgesel gen ekspresyon imzalarının incelenmesine izin verir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, glomerül ve proksimal tübül dahil olmak üzere insan böbrek dokusu içindeki belirli alt segmentlerin lazer mikrodisseksiyonu için bir protokol sunmaktadır. Bu bölmelerden izole edilen RNA, farklı böbrek yapılarıyla ilişkili gen ekspresyon modellerindeki değişikliklerin belirlenmesi için transkriptomik analize olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Transkriptomik analiz
- Böbrek biyolojisi
- Hastalık ilerlemesi araştırması
Arkaplan
- Böbrek alt segmentlerini incelemenin önemi
- Hastalık sonrası uzaysal olarak tanımlanmış yapıların analizindeki zorluklar
- Diğer omik teknolojileriyle tamamlayıcılık
Kullanılan Yöntemler
- Lazer mikrodissection
- İnsan böbrek doku örnekleri
- RNA izolasyonu ve dizileme
Temel Sonuçlar
- Diseksiyon ve RNA geri kazanımında yüksek başarı oranı
- Böbrek alt segmentleri için gen ekspresyon markörlerinin belirlenmesi
- Hastalık seyri ile ilişkili potansiyel yolakların gösterilmesi
Sonuçlar
- Bu protokol, böbrekteki bölgesel gen ekspresyonunu incelemek için etkili bir yöntemi göstermektedir.
- Bulgular, renal biyolojinin ve potansiyel hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik ve Önem
Lazer mikrodissection, disosyasyon tabanlı yöntemlerin anatomik bağlamı kaybettiği keşif biyolojisindeki kritik bir boşluğu doldurarak, insan böbrek dokusunun mekansal olarak çözümlenmiş transkriptomik profillemesini sağlar. Bu yaklaşım, gen ekspresyon imzalarını tanımlanmış nefron alt segmentlerine bağlayarak hedef doğrulamayı destekler ve renal hastalık modellerinde mekanistik risk azaltmayı geliştirir. Yöntem, erken keşif iş akışlarında yolak sorgulaması ve portföy önceliklendirmesi için öngörücü güven sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Gen ekspresyonunu anatomik olarak tanımlanmış böbrek bölmeleriyle eşleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Doku bağlamını koruyan mekansal olarak sabitlenmiş transkriptomik imzalar aracılığıyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Öngörücü Değer: Bölgesel marker ekspresyonunu fonksiyonel alt segment kimliğiyle ilişkilendirerek hedef güvenilirliğini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mikrodiseksiyonla ayrıştırılmış bölgelerden yüksek bütünlüklü RNA izole ederek, doğrulanmış biyolojik sistemleri sonraki omik iş akışlarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Örnek yeterliliğini ve diseksiyon başarı oranlarını değerlendiren kalite kontrol parametreleri aracılığıyla analiz standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Tarama kampanyaları için kantitatif, mekansal olarak çözümlenmiş transkriptomik çıktılar sağlayarak güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: İnsan böbrek alt segmentlerini kullanan hastalığa özgü sistem modellemesi aracılığıyla, keşif bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Biyobelirteç Uyumu: Dokuda tespit edilebilen kompartman spesifik gen ekspresyon profillerini tanımlayarak translasyonel biyobelirteç gelişimini destekler.
- Risk Ayarlı İlerleme: Anatomik olarak kesin ve hastalıktan etkilenmiş bölgelerdeki yolak aktivitesini ortaya çıkararak preklinik karar verme süreçlerini bilgilendirir.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Lazer mikrodisseksiyon, hipotez testinden öncü madde belirlemesine kadar olan keşif sürecine uyum sağlayarak, görüntüleme ile omik teknolojileri arasında köprü kuran ve mekansal olarak çözünür moleküler profillemeye olanak tanıyan bir yöntemdir.
- Keşif Biyolojisi: Gen ekspresyonunu böbrek dokusundaki yapısal işaret noktalarıyla ilişkilendirerek hipotez testini ve yolak açıklığa kavuşturulmasını destekler.
- Tarama: Yüksek başarı oranlı diseksiyon (>%90) ve sekanslama uygulamaları için yeterli RNA verimi sağlayarak analiz hazırlığı sunar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırmaya olanak tanıyan kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (gen tespit eşikleri ≥10.000 gen) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Dissosiyasyon tabanlı yöntemlerde kaybolan uzamsal bağlamı koruyarak preklinik sürekliliği ilerletir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Antikor belirteç değişimi yoluyla doku türleri genelinde yeniden kullanılabilir bir yetenek olarak işlev görür ve platform genelinde benimsenmeyi destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Renal hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış iş akışı parametreleri ve QC kontrol noktaları aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Alt segmente özgü biyolojiye dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi mümkün kılarak go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Mekansal olarak çözümlenmiş kanıtlar kullanarak renal hedeflerin erken aşamada riskten arındırılması yoluyla sermaye verimliliğini destekler.
Uygulama Hususları
- İmmünofloresan boyama ve renal alt segmentlerin morfolojik tanımlanması konusunda uzmanlık gerektirir.
- Lazer mikrodissection platformlarına ve düşük girdili örneklerle uyumlu RNA izolasyon kitlerine bağımlıdır.
- Boyama protokolleri, diseksiyon eşikleri ve QC metrikleri için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Farklı modeller arası adaptasyon, hedef dokulardaki antikor belirteçlerinin ve yapısal işaret noktalarının doğrulanmasını gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, bölge tanımlamasındaki kullanıcıya bağlı hassasiyet ve işlem sırasında RNA bütünlüğünün korunması yer almaktadır.
