Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Bu protokol, kraniofasiyal alandaki araştırmacıların, palatal raf yükselmesi sırasında mezenkimal yeniden şekillendirmeyi anlamanın bir yolu olarak kontrol ve mutant hücrelerdeki kolektif hareket niteliklerini nicel olarak karşılaştırmalarını sağlar. Primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin kullanımı ve hızlandırılmış görüntüleme, palatal raf yükselme dinamiklerini değerlendirmek için erişilebilir bir proxy yöntemi sağlar. Bir fare embriyosundan palatal kabukları toplamak için, sterilize edilmiş bir delikli kaşık kullanarak embriyonik bir gün olan 13,5 embriyonun stereo mikroskop altında steril MEPM kültür ortamı ile dolu steril 10 santimetrelik bir yemeğe yerleştirilmesini sağlar.

Kafa kesme işleminden sonra, sterilize edilmiş bir ince No.5 yaban ucunun bir ucunu yanağın hemen içindeki ağza yerleştirin ve kafatasının arkasından çıkana kadar asaların ucunu itin. Tostu, diğer kolun dokuyu kesmek için uzunlamaları sıkıştırmadan önce kulak kanalının hemen üzerinde gezinmesi için yönlendirin. Başın diğer tarafındaki kesiği tekrarlayın, kafatasının alt çenesi, dili ve alt kısmı çıkarılana kadar kıstırma kesme işlemine devam ederek palatal rafları açığa çıkarın.

Kafa yanına yerleştirilmişken, kafatasının hemen önünde ve arkasında bir çift küçük, steril, paslanmaz çelik makasın uçlarını embriyonun hemen göz hizasına yerleştirin ve kafatasının kafatasını çıkarmak için gözlerin hemen üstünden kesin, düz bir yüzey oluşturun. Daha sonra, başı, tabağın altına düz duran üstün yönüyle baş aşağı yerleştirin ve başın ön yarısındaki merkezi oluğun her iki tarafında iki yükseltilmiş köprü olarak görülebilecek palat raflarını bulun. Başı yemeğe sabitlemek için, ince bir ön kısmın burun bölgesine yakın dokudan bir ucunu palatal raflara, diğer ucunu da kafatası arka tabanının tabanından damak raflarına yerleştirin.

İkinci bir çift çok keskin, ince toskumun her iki noktasını da rafın yan yüzeyinin tabanındaki dokuya yerleştirin ve dokuyu kesmek için yavaşça ve dikkatlice sıkıştırın. Rafın medial yüzeyinin tabanı boyunca ve rafın hem ön hem de arka uçlarında kesiyi tekrarlayın, rafı ataşmanından başa ayırmak için rafı hafifçe kaldırın, kabuğu çevre dokudan tamamen serbest etmek için gerektiğinde ek kıstırmalar yaptı. İkinci palatal raf aynı şekilde çıkarıldığında, rafları buz üzerinde yaklaşık 500 mikrolitre PBS'de steril 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için steril bir plastik ampul transfer pipeti kullanın.

Bir MEPM hücre kültürü kurmak için, tüm raflar toplandığında, dokuları bozmadan PBS'yi aspire edin ve hemen her bir palatal raf dokusu tüpüne 37 santigrat derece 200 mikrolitre% 0.25 tripsin ekleyin. Dokuları birkaç kez pipetlamak ve beş dakika sonra kısa bir süre pipetleme yaparak dokuları 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırmak için 1.000 mikroliter pipet kullanın. Kuluçkanın sonunda, her tüpe 800 mikrolitre MEPM kültür ortamı eklemeden ve hücreleri toplamak için tüpleri santrifüjlemeden önce dokuları tekrar pipetle.

Süpernatantı aspire ettikten sonra, peletleri tüp başına bir mililitre taze MEPM kültür ortamına yeniden koyun ve hücreleri kuyu başına iki mililitre içeren altı kuyulu doku kültürü ile işlenmiş bir plakanın bireysel kuyularına, kuyu başına son toplam üç mililitreye kadar plakalayın, ardından hücrelerin steril bir hücre kültürü inkübatöründe 12 saat boyunca plastik yüzeye yapışmasına izin verin. 2D toplu göç tahlilini kurmak için, analiz edilecek her numune için bir steril iki kuyulu silikon kesici ucun üst kısmını yaklaşık bir milimetre yüksekliğe çıkarın ve kısaltılmış, steril iki kuyulu uçları altı kuyulu bir plakanın tek tek kuyularının ortasına kaplamak için steril forseps kullanın. Hücre kültürü inkübatöründe bir gecede inkübasyon için her kesici uçta toplam 40 ila 50 mikrolitre MEPM kültür ortamı hacminde kısaltılmış silikon kesici uçların milimetre kare başına kuyu diplerine ve tohum 300 MEPM hücresine tam olarak yapıştığından emin olmak için tüm kenarlar boyunca bastırın.

Bir yara onarım tahlilini ayarlamak için, bir değiştirilmemiş steril iki kuyulu silikon kesici ucu numune başına altı kuyulu bir plakanın ortasına yerleştirmek için steril tokmaklar kullanın ve kesici ucu kültür plakasına takmak için kesici ucun kenarlarına sıkıca bastırın. Daha sonra her kesici uçta 100 mikrolitre MEPM kültür ortamında milimetre kare başına 1.400 hücre tohum ve hücre kültürü ortamında 48 saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatır. 2D toplu göç tahlilini gerçekleştirirken, hücrelerin büyük bir kültür çanağında iki kuyulu silikon kesici uçlarda tohumlama genellikle görüntüleme için daha iyi hücre yoğunluğu sağlar.

35 milimetrelik bir çanağa yerleştirilen küçük 3D baskılı halkalar, 2D hareketlilik analizi için de kullanılabilir. Yara onarım tahlilleri için, hücreler yüksek izdihama kadar iki kuyulu silikon uçlarda yetiştirilir. Kesici uçlar daha sonra çıkarılır ve yaraya kadar görüntülenir.

MEPM yörüngeleri kalıcıdır ve hücre hareketliliğinin yönü birkaç saat boyunca korunur. Ortalama yer değiştirme ile zaman analizi, yer değiştirme biçimindeki kalıcılığın geçen zamanla orantılı olduğunu gösterir. Hareketlilik verilerinin akış analizi, birlikte hareket eden MEPM hücre kümelerinin yaklaşık 300 mikron büyüklüğünde olduğunu ortaya koymaktadır.

Vahşi tip ve mutant MEPM hücreleri arasında derin bir hareketlilik farkı da gözlenir. Bu prosedür çeşitli transgenik fare çizgilerinde ve MEPM hücrelerini hücre hareketi üzerindeki etkilerini incelemek için çeşitli biyokimyasal reaktiflerle tedavi etmek için kullanılabilir. Primer palatal mezenkim hücrelerine odaklandık, ancak zaman atlamalı görüntüleme ve nicel analizler, dinamik gelişim süreçlerinde herhangi bir hareketli hücre tipinin geçiş özelliklerini araştırmak için de kullanılabilir.