TCID50 Tahlilleri Kullanarak Viral Titrasyon için Görsel Sitopatik Etki Tabanlı Okumayı Geliştirmek için Kristal Menekşe Kullanımı
12 Şubat 2022
Bu protokol, viral titrasyonları optik mikroskopi ve immünositokimyasal boyama ile karşılaştırarak kristal mor kullanarak görselleştirmek için doğru ve objektif bir yaklaşım göstermektedir.
Bu protokolün amacı bir virüs stok titrasyonu üretmek ve kristal mor boyama kullanarak görselleştirmektir. Bunu yapmak için, genel bir viral titrasyon ve ardından lekeleme gösterilecektir. Bu titrasyon, biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarı içindeki bir biyogüvenlik kabininde yedi günlük bir süre boyunca 96 kuyulu bir plakada gerçekleştirilecektir.
Bunu yapmak için, tercih edilen hücre hattının 96 kuyulu bir plakası ilgili ortam kullanılarak tohumlanacak ve birleştiğinde büyümesine izin verilecektir. Virüs stoğu, 900 mikrolitre ortam ve 100 mikrolitre virüs veya karşılık gelen seyreltme karıştırılarak on kat seyreltme kullanılarak seyreltilecektir. Ortamın ve virüsün doğru şekilde karıştırılmasını sağlamak ve seyreltmelerdeki hataları önlemek için her tüpü girdaplayarak temizlemeyi unutmayın.
Enfeksiyon sürecinde yardımcı olmak için plakanızın düzenini ve her seyreltmeyi kurşuna yazın. Enfeksiyondan önce, 200 mikrolitre PBS kullanarak yıkayın. İlgili kuyulara 50 mikrolitre inoculum ekleyin.
Daha sonra, yedi gün boyunca% 5 CO2 inkübatörde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Yedi günlük inkübasyondan sonra, 200 mikrolitre PBS kullanarak yıkayın. PBS'de %4'te PFA kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyerek hücreleri sabitleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, sudaki kristal mor kuyusu başına 50 mikrolitre ilave etmeden önce hücreleri 200 mikrolitre PBS ile tekrar iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Son olarak, kuyulardan kristal menekşeyi epire edin ve isteğe bağlı olarak, plakaları oda sıcaklığında iki ila beş dakika kurumaya bırakın veya görselleştirmeden önce aşırı lekeyi gidermek için 200 mikrolitre su ile yıkayın. Sonuç olarak, yeniden lekelendikten sonra negatif hücreler lekelenir.
Pozitif kuyular temizlenecek. Bu bilgiler, son viral titrenizi hesaplamak için açıklanan iki formülden birinde kullanılacaktır. Her yöntemle elde edilen titer karşılaştırıldığında, monocyto kimyasında boyamanın bazı durumlarda kristal menekşe ile karşılaştırıldığında ek pozitif kuyular tespit edebildiği ve aynı şekilde her iki boyama yönteminin de mikroskopi ile görsel değerlendirmeden daha pozitif kuyular tespit edebildiği gösterildi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kristal viyole boyama kullanılarak viral titrasyonların görselleştirilmesi için doğru bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem; optik mikroskopi ve immünositokimyasal boyama ile karşılaştırılmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Viroloji
- Hücre Biyolojisi
- Laboratuvar Teknikleri
Arka Plan
- Viral titrasyon, virüs stoklarını miktarlandırmak için gereklidir.
- Kristal viyole boyama, viral varlığın görsel bir temsilini sağlar.
- Karşılaştırmalı yöntemler arasında optik mikroskopi ve immünositokimyasal boyama yer alır.
- Doğru sonuçlar elde etmek için uygun dilüsyon teknikleri kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Bir virüs stok titrasyonu oluşturmak.
- Kristal viyole boyama kullanarak titrasyonu görselleştirmek.
- Viral kantifikasyon yöntemlerinde doğruluğu sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Tercih edilen bir hücre hattının 96 kuyucuklu plakaya ekilmesi.
- Virüs stokunun on katlı dilüsyonlarının yapılması.
- Uygun karışım için her dilüsyonun vortekslenmesi.
- Yedi günlük inkübasyon süresinden sonra kristal viyole ile boyama yapılması.
Ana Sonuçlar
- Kristal viyole kullanılarak viral titrasyonların başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Diğer boyama yöntemleriyle yapılan karşılaştırmalar tutarlılık göstermiştir.
- Viral stokların doğru kantifikasyonu sağlanmıştır.
- Protokol, gelecek çalışmalar için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
Sonuçlar
- Kristal viyole boyama, viral titrasyonların görselleştirilmesi için etkili bir yöntemdir.
- Protokol, viral kantifikasyonun doğruluğunu artırır.
- Gelecekteki çalışmalar, çeşitli uygulamalar için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Doğru viral titrasyon, tutarsız CPE saptamasının öncü bileşik tanımlamasını ve karar alma süreçlerini tehlikeye atabileceği antiviral tarama ve aşı geliştirme çalışmaları için kritik öneme sahiptir. Kristal viyole boyama, immünositokimyasal boyamaya karşı maliyet etkin ve tekrarlanabilir bir alternatif sunarak assay standardizasyonunu iyileştirir ve erken keşif iş akışlarındaki değişkenliği azaltır. Bu durum, antiviral etkinlik değerlendirmelerinde öngörü güvenilirliğini destekler ve CPE oluşturan virüsler için ölçeklenebilir, yüksek kapasiteli TCID50 tabanlı taramalara olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Viral enfektivitenin objektif olarak nicelleştirilmesine olanak tanıyarak subjektif mikroskopiye olan bağımlılığı azaltır ve antiviral hedeflerin mekanistik risk analizini destekler.
- Operasyonel Değer: Antiviral hit doğrulamada analiz verimini ve tekrarlanabilirliğini artıran hızlı, düşük maliyetli bir boyama yöntemi sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: TCID50 analizleri için net ve ölçülebilir bitiş noktaları oluşturarak bileşik tarama kampanyalarında sinyal-gürültü oranını artırır.
- Operasyonel Değer: Pahalı ICC reaktiflerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak analiz başına maliyeti düşürür ve antiviral keşif platformlarında daha geniş uygulamalara olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Çalışmalar arasında tutarlı viral titer ölçümleri sağlayarak, preklinik etkinlik çalışmalarında güvenilir doz-yanıt modellemesini destekler.
- Operasyonel Değer: Viral stok hazırlığının laboratuvarlar arası standardizasyonunu kolaylaştırarak, IND onayına yönelik çalışmalarda deneyler arası değişkenliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hit onaylamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar uzanan antiviral keşif sürecine uygundur; burada doğru viral titrasyon, yapı-aktivite ilişkileri ve direnç profillemesi hakkında bilgi sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Etki mekanizması çalışmaları için tekrarlanabilir viral challenge modelleri sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Antiviral tarama basamaklarında hit-to-lead ilerlemesi için gerekli olan standartlaştırılmış, nicelleştirilebilir çıktılar sunar.
- Analitik: TCID50 değerlerinin kesin hesaplanmasını sağlayarak, bileşik potansiyellerinin farklı deneysel koşullar arasında doğru şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Tutarlı viral stok nicelleştirmesi yoluyla, in vitro antiviral taramadan in vivo challenge modellerine geçişte süreklilik sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla viral hedef ve terapötik alanda uygulanabilen, ölçeklenebilir ve düşük maliyetli bir kapasiteyi temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Görsel CPE değerlendirmesinden kaynaklanan yanlış negatifleri azaltarak antiviral etkinlikteki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Basitleştirilmiş, standardize boyama yoluyla TCID50 analizlerinin tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Veri kalitesinden ödün vermeden analiz maliyetlerini düşürerek antiviral programlarındaki sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: go/no-go kriterleri için güvenilir viral titer verileri sağlayarak riskle uyumlu ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- BSL-2 ortamlarında güvenli virüs kullanımı için temel viroloji eğitimi ve aseptik teknik gereklidir.
- İnkübatörler, santrifüjler ve isteğe bağlı kantifikasyon için plaka okuyucular dahil standart laboratuvar ekipmanlarına bağlıdır.
- Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği sağlamak için boyama süresi ve yıkama protokolleri konusunda ekipler arası mutabakat gereklidir.
- CPE oluşumunu destekleyen adherent hücre hatları için uygulanabilir; adherent olmayan veya CPE indüklemeyen virüsler için optimizasyon gerekebilir.
- Saptanabilir sitopatik etki indükleyen virüslerle sınırlıdır; modifikasyon yapılmadan sitopatik olmayan veya persistan enfeksiyon modelleri için uygun değildir.
