İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Protokol aynı anda yarı katı bir agar üzerindeki farklı indükleyici konsantrasyonlarına bakteriyel kaynaşma tepkilerini izler. Bu, uygun maliyetli bir şekilde elde edilir. Bu yüksek verimli tarama tekniği, mikrokemotaktik yanıtları gözlemlemek için çeşitli indükleyici konsantrasyonlarına sahip agar ihtiyacını ortadan kaldırır.

Bu teknik, ilaç taraması ve ayrıca mikropatojen SD yanıtlarını gözlemlemek için tasarlanmıştır. Ayrıca, insan konakçısındaki çeşitli biyokimyasal ipuçlarına mikro tepkileri incelemek için de kullanılabilir. Bu yöntem bakteriyel kemotaksiler hakkında fikir verebilir.

Bakteriler, pozitif kemotaksis veya negatif kemotaksis olarak bilinen kimyasal kovucular olarak bilinen çeşitli kimyasal çekicilik konsantrasyonlarına cevap verecektir. Tekrarlanabilirlik sorununu önlemek için alt tabakanın jel açısı arasında bir değişiklik olmasını önlemek için dikkatlice hazırlanmış bir kurulum gereklidir. Başlamak için, 13 x 13 santimetre kare Petri yemeklerini lekeler ve indükleyici isimlerle etiketleyin.

Ardından bulaşıkları kapakların kenarından yukarı doğru yerleştirin. Sıcak alt tabaka ortamına arabinoz çözeltisi ekleyin. 40 mililitre ılık alt tabaka ortamı ekleyin.

Alt tabaka ortamının, laminer bir akış başlığının içinde rahatsız edilmeden bir saat boyunca açıkta kalmasını bekleyin. Alt tabaka tamamen katılaştıktan sonra, kapakları çıkarın ve Petri kaplarını laminer bir akış başlığı içine yerleştirin. Motorlu pipet filtresi kullanarak 40 mililitre sıcak üst tabaka ortamı ekleyin.

Kapalı ve rahatsız edilmemiş çift katmanlı plakaları bir saat boyunca kürleyin, ardından 24 saat boyunca dört santigrat derecede saklayın. İşaretli A4 kağıdını iyi katılaşmış bir gradyan plakasının altına yerleştirin. 100 mikrolitrelik pipet ucunun daha geniş tarafını işaretli konumda yarı katı ortam yüzeyine itin ve pipet ucunu üst tabaka ortamının dibine ulaşana kadar bastırın.

Uç tabana dokunduğunda, uca herhangi bir dikey kuvvet uygulamayı bırakın ve silindirik kuyucuğun içeriğini izole etmek için ucu yavaşça döndürün. Pipet ucunu yatay olarak küçük bir mesafe boyunca hareket ettirerek hava akışının bir kenara bırakılan dar yere girmesini sağlayın. Ucun içindeki gaz akışını engellemek için ucu işaret parmağınızla bastırın.

Ucu dikey olarak dışarı çekin, dışarı çekerken kuyu içeriğini uçta tutun. Her kuyucuğa gecelik büyüme kültürünün 80 mikrolitresini ekleyin. Sürü plakalarını her 12 saatte bir inkübatörden birer birer çıkarın ve jel görüntüleme sistemine yerleştirin.

Jel görüntüleme modunu seçin, sürü plakasını beyaz ışığa maruz bırakın ve sürülerin net bir görünümünü elde etmek için odak uzaklığını ayarlayın. Pozlama süresini 300 milisaniyeye ayarlayarak hassas gözlem için sürülerin parlaklığını artırın. Arka plan ışığından kaynaklanan paraziti en aza indirmek için eşiği ayarlayın.

Daha fazla analiz için görüntü dosyasını kaydedin. Görüntüleme süresini, indükleyici türünü, gradyan yönünü ve gerinimleri bir txt dosyasına kaydedin. Görüntünün keskinliğini artırmak için İşleme'yi, ardından Gölgeler'i tıklayın.

Görüntüyü işlemek için İşlem'e ve ardından Toplu İşlem'e tıklayın. Ardından İşlem, Gölgeler ve Güney'e tıklayarak bir görüntüyü referans olarak işleyin. Toplu İşlem penceresini açmak için İşlem, Toplu İşlem, Makro'yu tıklatın.

Pencerede görüntülenen komutları arayın. Toplu İşlem penceresinde İşlem'i tıklatarak çıktı dosyası adresine özgün görüntülerin klasör adresini yazın. Sürüleri tek tek seçmek için değnek izleme aracını kullanın ve oluşturulan çizgi sürü sınırına doğru şekilde uyana kadar toleransı ayarlamak için değnek izleme aracına çift tıklayın.

Alan değerini dışa aktarmak için Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayın. E.coli K12 YdeH, bitişik kuyucuklar arasında meydana gelen örtüşme ile yüzey kaynama işlemini göstermek için kullanılan arabinoz gradyan plakaları üzerinde test edilmiştir. Üç test kuyusuna sahip bir plaka, örtüşmeyen sınırların oluşumunu sağladı.

P.aeruginosa PAO1 YdeH kaynama hareketliliği, en düşük konsantrasyondan artan arabinoz konsantrasyonu ile desteklendi, ancak kademeli olarak daha yüksek konsantrasyonlarda arabinoz konsantrasyonları ile sınırlandırıldı. Sıfır ila 400 mikrolitre konsantrasyon aralığındaki resveratrol gradyan plakaları üzerinde test edilen E.coli K12 vahşi tip suşlar, artan resveratrol konsantrasyonu ile sürü hareketliliğinin mütevazı bir kısıtlamasını göstermiştir. Sürü alanları ImageJ yazılımı ile ölçüldü.

Sürü eğrisi çoklu konsantrasyon tepkilerini gösterdi. Bu prosedürün en önemli kısmı, belirli bir konsantrasyon aralığında indükleyicilere sahip çift katmanlı bir sürü plakası üretmektir. Bu yöntem, araştırmacıların belirli bir konsantrasyon aralığında indüklenen yüzey kaynaşmasını araştırmalarını ve diğer indükleyicilerin ve bileşenlerin kaynaşma üzerindeki etkilerini ölçmelerini sağlar.