CRISPR-Cas12a ile Kombine Rekombinaz Polimeraz Amplifikasyonu Kullanılarak Sahada Konuşlandırılabilir Candidatus Liberibacter asiaticus Tespiti

Huang long bing, HLB olarak kısaltılmıştır. Dünya çapında yıkıcı bir narenciye hastalığıdır. Çin ve ABD gibi en narenciye üreten ülkelerde, HLB'ye CLas olarak kısaltılan floem kısıtlamalı bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus neden olur.

CLas'ın erken teşhisi, erken müdahaleyi kolaylaştıran ve hastalığın yayılmasını önleyen yetiştiriciler için önemliydi. Bu yüzden burada hızlı ve taşınabilir HLB tanısı için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu ve CRISPR-Cas12a sistemi ile birleşen yeni bir yöntem geliştirdik. Biz buna CLas-DETECTR adını verdik.

Platformumuzun hassasiyeti PCR'den çok daha yüksektir. Ayrıca, yaprak örnekleri kullanıldığında qPCR ile benzer sonuçlar gösterir. Geleneksel CLas algılamalarıyla karşılaştırıldığında, yöntemimiz 90 dakika içinde tamamlanabilir ve izotermal bir durumda çalışır.

Sonuç, sahadaki bir el tipi floresan algılama cihazı aracılığıyla da görselleştirilebilir. CLas-DETECTR dört adımdan oluşur: çözelti hazırlama, narenciye toplam DNA izolasyonu, izotermal DNA amplifikasyonu ve görselleştirme sonuçları. CLas-DETECTR testinin şeması burada gösterilmiştir.

Tampon A, Çözüm B ve Çözüm C, protokolde açıklandığı gibi hazırlanır. Zamandan tasarruf etmek ve bu yöntemi alan CLas tespiti için uygun hale getirmek için, DNA amplifikasyonu için ham bitki özleri elde etmek için E.coli polietilen glikol bazlı yaklaşım kullanılmıştır. Narenciye yaprakları alette kullanılır.

Birkaç parça yaprak diskini yapraktan delin. Yaprak diskleri 1,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpüne koyun. Ardından, tüpe 200 mikrolitre Tampon A ekleyin.

Yaprak diskleri plastik bir çubukla pürüzsüz hale gelene kadar manuel olarak öğütün. Tüpü 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Süpernatant daha sonra DNA amplifikasyonuna uygulanır.

İzotermal DNA amplifikasyonu için, adım 2.3'ten bir mikrolitre süpernatant ve bir mikrolitre magnezyum asetat çözeltisi B'ye ekleyin ve iyice karıştırın. Laboratuvarda, onları 15 dakika boyunca 37 derecede basit bir inkübatörde inkübe edin. Sonuçları görselleştirmek için, 3.2. adımdan itibaren 10 mikrolitre karışımı çözelti C'ye ekleyin ve iyice karıştırın.

Onları 37 derecelik inkübatörde 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir gözlük takın ve el tipi bir floresan algılama cihazı aracılığıyla yeşil floresan sinyalini gözlemleyin. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü test etmek için, Agrobacterium tumefaciens GV3101'in ilk saf kolonileri, Xanthomonas citri subsp.

Laboratuvarımızda izole edilen citrus canker ve Burkholderia stabilis suşu 1440'ın patojeni olan sitri, genomik DNA'larını çıkarmak için kullanıldı. Daha sonra bu üç bakteri genomik DNA'sı ve CLas-pozitif Newhall yaprakları genomik DNA'sı CLas-DETECTR testine tabi tutuldu. CLas-DETECTR'ın duyarlılığını test etmek için, protokolde açıklandığı gibi PCR, CLas-DETECTR ve qPCR kullanılarak bir dizi CLas DNA fragmanı seyreltmesi tespit edildi Özgüllük ve duyarlılık testinden sonra, CLas-DETECTR yöntemi CLas'ın sahadaki varlığını tespit etmek için kullanıldı.

Gannan Normal Üniversitesi, Jiangxi, Çin kampüsündeki germplazma kaynak fidanlığında yetiştirilen Newhall tatlı portakal ağacından toplanan yaprak örnekleri. qPCR, genellikle laboratuvarda kullanılan ikna edici bir CLas tespit yöntemi de uygulanmıştır. Laboratuvarımızda CLas'ın varlığının doğrulandığı HLB-enfekte ve HLB-enfekte olmamış Newhall ağacından elde edilen yaprak örnekleri, CLas-DETECTR testine tabi tutuldu.

Yeşil floresan sinyali, HLB ile enfekte olmuş numunede yakalandı, ancak HLB-enfekte olmamış ve negatif kontrolde yakalanmadı. CLas-DETECTR'ın özgüllüğünü, diğer bakterilerden ekstrakte edilen nükleik asitleri kullanarak belirledik. CLas-DETECTR testinde, sadece CLas-pozitif Newhall yapraklarından ekstrakte edilen gDNA yeşil floresan sinyalleri gösterdi.

Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ve Burkholderia stabilis suşu 1440'tan ekstrakte edilen gDNA, CLas-DETECTR'ın CLas'ı spesifik olarak tespit edebileceği anlamına gelir. Ayrıca CLas-DETECTR'ın duyarlılığını, protokolde listelenen bir dizi CLas DNA seyreltmesi kullanarak test ettik.

PCR, megalitre başına 201 kopya tespit edebilir. Öte yandan, CLas-DETECTR megalitre başına 2.01 kopya tespit edebilir ve bu da hassas bir alan teşhisi olarak kullanılabilirliğini gösterir. qPCR, megalitre başına 0,201 kopya algılayabilir ve Ct değeri 36'dan yüksektir.

Bu nedenle CLas-DETECTR, geleneksel PCR'den iki büyüklük sırasına göre daha hassastır ve seyreltilmiş CLas'a özgü amplikonlar kullanıldığında qPCR'den daha az hassas bir büyüklük sırasına sahiptir. Son olarak, CLas-DETECTR'ın saha örnekleri için fizibilitesini yeniden inceledi ve duyarlılığını qPCR ile karşılaştırdı. Rakamlarda görüyoruz.

CLas konsantrasyonu megalitre başına 0.2 kopyadan az olduğunda Ct değerinin 36'dan yüksek olduğunu görebiliriz, bu da çok düşük bir konsantrasyondur. 15 örneklem arasında, qPCR ile saptanan 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ve 14 numaralı örneklerin Ct değeri 36'dan azdı. Belirgin bir yeşil floresan sinyalleri gözlendi.

Öte yandan, qPCR ile tespit edilen 6, 7, 9, 12 ve 15 örneklerinin Ct değeri belirlenmediğinde, yeşil floresan sinyalleri gözlenmemiştir. Ek olarak, qPCR ile tespit edilen örnek 5 ve 11'in BT değeri 36'dan yüksek olduğunda zayıf yeşil floresan sinyalleri gözlenmiştir. Sonuçlar, platformumuzun sahada HLB teşhisi için hızlı, sağlam ve hassas bir araç olduğunu gösterecektir.