İki Foton Holografik Mikroskopi Kullanılarak Nöral Aktivitenin Değerlendirilmesi ve Manipülasyonu

Bu protokol, nöroaktivite hakkında doğru mekansal zamansal bilgi sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, nöroaktiviteyi yüksek mekansal zamansal çözünürlükle manipüle etme ve değerlendirme yeteneğidir. Nöral aktivitede anormalliklere yol açan nöropsikiyatrik bozuklukların patojenlerini göstermek için yararlı olabilir.

Bu yöntem, nöronların yanı sıra diğer organlardaki sağlığın incelenmesine de uygulanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora yüksek lisans öğrencisi Zhongtian Guo olacaktır. Kafa plağı implantasyonundan bir gün sonra, serebral ödemi önlemek için ameliyattan bir saat önce kilogram deksametazon sodyum fosfat intraperitoneal olarak 1.32 miligram uygulayın.

Bir stereoskop altında, bir diş matkabı kullanarak yaklaşık iki milimetre çapında dairesel bir kraniyotomi yapın. Beyin hasarını azaltmak için, diş matkabını sürekli hafif hareket ve hafif aşağı doğru basınçla dikkatlice çalıştırın. Bir emme sistemi kullanarak kemik parçalarını birkaç kez çıkarın.

Kemik parçasını çıkardıktan sonra, beynin yüzeyinde kalan kalıntıları çıkarmak ve yıkamak için yapay bir omurilik sıvısı veya ACSF çözeltisi kullanın. Enflamatuar reaksiyonları bastırmak için bu temizleme prosedürünü birkaç kez tekrarlayın. Bir basınç enjeksiyon sistemi kullanarak, 10 dakika boyunca uç çapı 10 ila 20 mikrometre olan bir cam kılcal damardan 500 nanolitre AAV çözeltisi enjekte etmek için uygun basıncı ayarlayın.

Cam kılcal damardaki AAV çözeltisinin seviyesi kademeli olarak azalırsa, AAV çözeltisi beyne uygulanır. Geri akışı önlemek için cam kılcal damarı 10 dakika daha yerinde bırakın. Beyne toplam 1.5 mikrolitre AAV çözeltisi uygulamak için bunu üç kez tekrarlayın.

Bir mikropipet kullanarak S1'in beyin yüzeyine% 2 düşük erime gösteren agaroz uygulayın ve ardından iki kapak gözlüğü ile kraniyotominin üzerine bir cam pencere yerleştirin. Kapak camını hala sıvı iken agaroza bastırın. Bu, agarozda hava kabarcıklarının oluşumunu önler.

Kraniyal pencerenin kenarlarını diş yapıştırıcı reçine çimentosu ile kapatın. Holografik stimülasyon sistemini kalibre etmek için, kırmızı floresan slaydın yüzeyini numune düzlemine yerleştirin ve mikroskobu zayıf bir uyarma ışığı ile canlı görüntüleme moduna ayarlayın. Kalibrasyon GUI'sini çalıştırın.

mfile, parametreler bölmesini kontrol edin ve Kaydet düğmesine tıklayın. Her düzlemden iki mikrometre uzaklıktaki 21 farklı eksenel düzlemde otomatik olarak üç rastgele nokta oluşturacaksa, birinci adım bölmesindeki Z Taraması düğmesini tıklatın. Kaydırma çubuğunu hareket ettirin ve canlı görüntüyü kontrol edin.

Noktaların en küçük ve en parlak göründüğü mükemmel düzlemi bulun ve ardından Kaydet düğmesine tıklayın. Bu, dijital hologram için otomatik olarak ofset küresel bir dalga cephesi oluşturacaktır. İkinci adım bölmesindeki Git düğmesini tıklatın ve ardından sol karedeki altı noktayı tıklatın.

Canlı görüntüyü kontrol edin. Altı ayırt edilebilir floresan nokta varsa, x ve Y eksenlerini düzenleme kutularına yazın ve Kaydet düğmesine tıklayın. Bu, holografik stimülasyon ve görüntüleme sistemi arasındaki kalibrasyonu koordine etmek için otomatik olarak ince bir dönüşüm katsayısı oluşturacaktır.

Ardından, üçüncü adım bölmesindeki Tara düğmesini tıklatın. 21 x 21 adımda görüş alanı boyunca tek nokta taraması yapmak için 441 dijital hologram üretecek. Liste kutusundaki desenleri değiştirirken görüntüleri kontrol edin.

Görüntüleme cihazının dinamik aralığında spot görüntüler elde etmek için lazer gücünü ayarlayın. Görüntüleme cihazını kayıt moduna getirin ve Oyun düğmesine basın. Oynatma tamamlandıktan sonra, dördüncü adım bölmesinde Ağırlık Haritası Oluştur'u tıklatın ve yığılmış bir görüntü seçin.

Ardından kalibrasyon GUI penceresini kapatın. Her noktadaki dengesiz yoğunluğu telafi etmek için otomatik olarak bir ağırlık haritası oluşturacaktır. AAV enjeksiyonlu fareyi mikroskop altına bir kafa plakası ile yerleştirin ve holografik bir mikroskop ve 25x hedefle 920 nanometreye ayarlanmış mod kilitli titanyum safir lazer kullanarak iki foton görüntüleme gerçekleştirin.

Ticari görüntüleme yazılımını canlı görüntüleme modunda açın. GCaMP8f'yi ifade eden nöronların parlaklığını optimize etmek için görüntü dedektörünün voltajını ve görüntüleme lazerinin gücünü ayarlayın. Bu proteini ifade eden nöronların görüntülerini yakalayın.

Belirli nöronları holografik aydınlatma ile aydınlatmak için, SLMcontrol'ü çalıştırın. m komut dosyası. Referans resme tıklayın ve alınan resmi seçin.

Ardından, görüntüdeki nöronlar üzerinde belirli pikselleri seçmek için Spot düğmesine tıklayın ve sonlandırmak için klavyedeki Enter düğmesine basın. Bir görüntü sensörü kullanarak yüksek zamansal çözünürlüğe sahip sinirsel aktiviteyi algılamak için pozlama süresini, görüntüleme alanını ve bölmeyi ayarlayın, ardından görüntü alımını gerçekleştirin. Fareyi mikroskop altına yerleştirdikten ve iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirdikten sonra, ticari görüntüleme yazılımını açın.

Canlı görüntüleme modunda, GCaMP-6m-p2A-ChRmine eksprese eden nöronların parlaklığını optimize etmek için görüntü dedektörünün voltajını ve görüntüleme lazerinin gücünü ayarlayın. Bu proteinleri ifade eden nöronların görüntülerini yakalayın ve daha önce gösterilen prosedürü izleyerek spesifik nöronları aydınlatın. İkinci ve üçüncü katman nöronlarındaki fonksiyonel bağlantıyı araştırmak için, optogenetik stimülasyonun holografik modellerini oluşturmak ve bunu iki fotonlu kalsiyum görüntüleme ile birleştirmek için uzamsal bir ışık modülatörü kullanın.

Görüntüleme lazerinin yoğunluğunu 10 ila 20 miliwatt'ta 920 nanometreye ve görüş alanını kortikal yüzeyden 100 ila 150 mikrometre derinlikte ölçülen 256 mikrometreye 256 mikrometre olarak ayarlayın. Piksel bekleme süresini iki hertz için 1,5 mikrosaniye veya 30 hertz için 100 nanosaniye olarak ayarlayın. Tek bir holografik uyaranın nöronlarda kalsiyum tepkisine neden olup olmadığını görmek için görüntüleme kare hızı olarak hem iki hertz hem de 30 hertz kullanın.

Tek bir nöronu uyaran holografik stimülasyon lazerinin yoğunluğunu, sinirsel aktiviteyi indüklemek için yeterli olan 10 miliwatt'ta ayarlayın. Aynı zamanda, kalsiyum demir tepkisini 920 nanometrede, 1040 nanometrede 10 holografik uyaranla ve sekiz saniye aralıklarla 10 saniyelik bir başlangıç periyodundan sonra 50 milisaniyelik bir süre boyunca görüntüleyin. Bundan sonra, fareyi ev kafesine geri getirin.

Holografik stimülasyon ve bir görüntü sensörü ile 100 hertz görüntülemede GCaMP8f'yi ifade eden nöronların temsili görüntüsü ve izleri burada gösterilmiştir. Bu grafik, her lazer gücünde holografik stimülasyona verilen nöral tepkiyi göstermektedir. İki hertz ve 30 hertz görüntüleme kare hızlarında 10 farklı nöronun holografik stimülasyonu sırasında temsili Kalsiyum 2 + izleri burada sunulmuştur.

Aynı renk aynı nöronu gösterir. Nöronlar arasındaki fonksiyonel bağlantıları değerlendiren şematik bir diyagram burada tasvir edilmiştir. Turuncu nöron uyarıldığında, kırmızı nöronlar aynı anda yanıt verir ve bu nöronlar arasında işlevsel bağlantı olduğunu gösterir.

GCaMP6m'yi vahşi tipte eksprese eden birincil somatosensoriyel korteks nöronlarının tipik bir görüntüsü burada gösterilmiştir. Bu grafik görüntüler, holografik stimülasyon sırasında iki hertz ve 30 hertz görüntüleme kare hızlarında tipik Kalsiyum 2 + izlerini temsil eder. Holografik stimülasyona nöro yanıt hem iki hertz hem de 30 hertz görüntüleme hızlarında tespit edilebilir.

Bu adımlar beyin hareketini azaltmak ve ikincisi, istikrarlı sonuçlar elde etmek için önemlidir. Bu mikroskobun, belirli kalıplara sahip nöronların yazılmasında davranışı tetikleyebileceğine inanıyoruz. Bu teknikle, artık bireysel nöronun aktivitesini değerlendirebilir ve manipüle edebilir ve nöropsikiyatriyi ayrıntılı olarak karakterize edebiliriz.