Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

FollowMe deneyinin genel amacı, çok sayıda nörondan nöral spike aktivitesini kaydetmektir. Bu, ilk adımda floresan mikroskobu kullanılarak, her aksiyon potansiyeli ile ilişkili olan bir nöron somasındaki hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki artışın gözlemlenmesiyle gerçekleştirilir. 40 nöron somasından yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle kalsiyum floresan sinyallerini kaydetmek için iki foton uyarımı ve rastgele erişimli tarama prensibi kullanılır.

İkinci adımda, kesin spike zamanlamaları bir dekonvolüsyon algoritması kullanılarak floresan sinyallerden çıkarılır. Bu teknik, onlarca nöronun spiking aktivitesini kaydetmek için kullanılabilir. Spiking verileri daha sonra karşılıklı bilgiyi, nöronal popülasyonlar arasındaki sinyal iletimini veya nöro korelasyonları ölçmek için kullanılabilir.

Bu tekniğin mikro elektrot kayıtları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yerel bir populatingten çok sayıda nöronun spike aktivitesinin kaydedilebilmesidir. Bu yöntem; bilginin korelasyon arayışının önemi ve kortikal plastisite ile ağ dinamiklerindeki değişiklikler gibi, nöronların yerel ağları düzeyinde kortikal fonksiyon hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İki foton uyarımı için, femtosaniyelik impulslara sahip bir kızılötesi pulse lazer sistemi kullanılır. Sistemin optik bileşenleri tarafından oluşturulan büyük kayıpları telafi etmek için yüksek bir lazer çıkış gücü gereklidir.

İki prizmadan oluşan bir sistem, AOD'lerin neden olduğu zamansal dispersiyonu telafi etmek için özel optik deflektörlerden önce lazer darbelerine negatif grup hız dispersiyonu uygular. Geniş açıklıklı iki AOD, lazer ışınını iki boyutta saptırır. AOD'lerin neden olduğu uzaysal dispersiyonu telafi etmek için, AOD'lerin 13 santimetre arkasına milimetre başına 100 çizgiye sahip yansıtıcılı bir difraksiyon ızgarası yerleştirilir. Kısa lazer darbeleri kullanıldığında, lazer ışını iki röle teleskopu ile dik bir mikroskobun kamera portuna yönlendirilir.

Optik bileşenlerin hizalanması için irisler düzenli aralıklarla yerleştirilir. Objektifin önündeki dikroik ışın bölücü, kızılötesi eksitasyon ışığını numuneye iletir ve numuneden gelen floresans ışığını bir dedektöre yansıtır. Epi ve trans floresans dedektörleri, floresans sinyalini objektif aracılığıyla toplar ve eksitasyon ışığının dedektörlere ulaşmasını önlemek için dedektörlerin önüne renkli cam filtreler yerleştirilir.

A OD sapma açıları, voltaj kontrollü osilatörleri süren dijital analog dönüştürücü kartı donanımlı bir bilgisayar tarafından kontrol edilir. Fotomültipliyerlerden gelen sinyal, 100 kilohertz kesim frekanslı bir düşük geçiren Butterworth filtresi üzerinden iletilir ve analiz için bilgisayara kaydedilmeden önce 156.25 kilohertz saat hızıyla bir analog dijital dönüştürücü tarafından dijitalleştirilir; hizalama ve elektriksel gürültü testleri, fotomültipliyerlerin düşük ve yüksek kazançlarında, ayrıca indikatör varken ve yokken, lazer ışığı ile ve lazer ışığı olmadan floresan sinyallerinin dağılımı kaydedilerek test edilir. Rastgele erişimli tarama, hücre içi kalsiyum artışlarının tespitine dayanır. Protokolün ilk adımı, bolus enjeksiyon yoluyla çok sayıda nöronun bir kalsiyum indikatörünün ester formu ile boyanmasıdır.

Ardından, her bir nörondaki soma aktivitesini, dört farklı konumun her birinde 6,4 mikrosaniye boyunca kaydedin. İlgilenilen nöronları seçmek için 256 x 256 pikselden oluşan tam bir kare görüntü alın. Daha sonra, bu görüntü içerisinde kaydedilecek nöronların merkezlerini manuel olarak seçin.

Kontrol yazılımı tarafından her döngüde, her merkezin etrafına iki mikron mesafeyle üç nokta otomatik olarak eklenir. Toplam 40 nöronun tamamında, dört konumdan floresan sinyali kaydedilir. Tüm nöronlardan tek bir döngüde kayıt yapılması 1,536 milisaniye sürer.

Tüm 40 nöronun bu ardışık kaydını beş saniye boyunca tekrarlayın. Floresan somatik kalsiyum sinyallerinden spike tespiti, yüksek bir sinyal-gürültü oranına dayanır. Yüksek bir sinyal-gürültü oranı, eksitasyon yoğunluğu artırılarak elde edilebilir.

Bununla birlikte, fotohasar nedeniyle eksitasyon şiddeti yalnızca belirli bir sınıra kadar artırılabilir. Kaydedilen sinyallerin yüksek spike tespit penceresi içinde olduğundan emin olmak için, fotohasarın düşük ve sinyal-gürültü oranının tekil spike'ları tespit etmek için yeterli olduğu eksitasyon şiddeti penceresi oldukça dardır. Deney sırasında, laboratuvarımız tarafından geliştirilen bir dizi çevrimiçi analiz yazılımı kullanılır.

Ardından, yaklaşık 100 ila 200 milisaniyelik kısa bir bazal gürültü zaman penceresinden nöron başına yaklaşık foton hızını hesaplayın. Foton sayısı ve foton hızı, göreceli floresans değişimlerinin dağılımı bu denklemle uydurularak floresans değerlerinden hesaplanır; ardından aynı zaman penceresinden bazal floresans hesaplanır ve zamana veya denemelere bağlı bir fonksiyon olarak grafiğe dökülür. Lazer gücünü ayarlayarak, bazal floresanstaki ortalama azalmayı saniyede 0,0002'nin altında tutun.

Çünkü bu sınır aşıldığında spike tespiti hızla azalır. Bundan sonra, tam kare bir görüntü alarak nöron somatik konumlarını her 10 ila 20 dakikada bir doğrulayın. Gerektiğinde kayıt konumlarını ayarlayın.

Nöral aktivite sonucu ortaya çıkan floresan sinyaller, kalsiyum geçici durumunun uzun sönümleme süresi nedeniyle genellikle zaman içinde yayılır. Bu prosedürde, floresan sinyallerden spike'ları ve spike zamanlamalarını elde etmek için bir dekonvolüsyon yöntemi kullanılır. Burada, kaydedilen floresan sinyale en uygun olan en olası spike treni modelini belirlemek için bir genetik algoritma kullanıyoruz.

Algoritmanın her yinelemesinde, maksimum olabilirlik, floresan kayıtlarının gürültüsü tarafından belirlenen maksimum değerine asimptotik olarak yaklaşır. Homojen olmayan nöron popülasyonlarında, spike ile tetiklenen kalsiyum sinyali nöronlar arasında farklılık gösterebilir. Büyük veri setlerinin gözetimsiz analizi için, çok sayıda yanlış pozitif saptamayı önlemek amacıyla, spike ile tetiklenen kalsiyum sinyalinin nöronlar arasındaki varyasyonunu dikkate alan bir algoritma tasarladık.

Tek spike ile uyarılan kalsiyum geçişlerinin genliği ve sönümlenme zaman sabitinin ortak dağılımı, aynı deneysel koşullar altında, aynı tip nöronlardan oluşan ayrı bir deney setiyle kaydedilmiştir. Yavaş bazal değişimleri hesaba katmak ve dekonvolüsyonun hesaplama maliyetlerini azaltmak için, uzun kayıtlar her bir kayıttaki her nöron için bir ila beş saniyelik birkaç daha kısa izlere bölünmüştür; dekonvolüsyon algoritması, 1 milyon veya daha fazla farklı modele kadar çok sayıda modeli test edebilir ve dekonvolüsyonu hızlandırmak için tek bir deney, paralel olarak 10 farklı bilgisayara kadar dekonvolüte edilir.

Dekonvolüsyon işleminden sonra, spike verileri analiz edilir ve incelenir. Peri-stimulus zaman histogramı spike olasılığı ve nöron ateşleme hızı otomatik bir şekilde hesaplanır. Burada, tespit penceresi içerisinde çok düşük eksitasyon hızında kaydedilmiş bir floresan sinyal örneği ile diğer tarafta çok yüksek eksitasyon hızında kaydedilmiş bir örnek yer almaktadır.

Her bir örneğin tek bir spike'a verilen yanıtı gösterdiğine dikkat edin. Burada, bir akut beyin kesitinin ve aynı kortikal kolona yerleştirilmiş iki stimülasyon pipetinin foto-mikrografı gösterilmektedir. Tabaka dörtte, bunlar tekrarlayan stimülasyonlar için nöral yanıtları göstermekte ve bu grafik, kaydedilen nöron popülasyonu tarafından sinyallenen Shannon karşılıklı bilgisini göstermektedir.

Burada, farklı kortikal nöron popülasyonları arasındaki eşik üstü spike aktivitesinin yayılımının ölçümü yer almaktadır. Bunlar, talamokortikal fiberlerin elektriksel stimülasyonuna karşı kortikal nöronlarda saptanan spike'lardır. Rastgele erişimli tarama (random access scanning) kullanarak nöronal aktivite kaydı yapılırken, tespit penceresi içerisinde kayıt yapılması oldukça önemlidir.

Aksi takdirde, kullanılamaz veri setleriyle karşılaşmak çok kolaydır. Optik spike tespiti henüz başlangıç aşamasındadır. Geliştirilmeye açık pek çok alan bulunmaktadır.

Bazı iyileştirmelerle, daha fazla nörondan kayıt yapıyoruz. Diğer iyileştirmelerle, uyanık ve davranış sergileyen hayvanlarda da kayıt yapabileceğiz.