Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskobu Kullanılarak Hücre Çekirdeğinde Mutlak DNA Yoğunluğunun Haritalanması

Mevcut yöntem, hücre çekirdeklerindeki mutlak DNA yoğunluğu ölçümlerinin, aksi takdirde yalnızca translasyon sonrası histon modifikasyonları ile karakterize edilen kromatin yapılarındaki uzamsal kısıtlamaları araştırmasına izin verir. SMLM ile birleştirilmiş Voronoi mozaiklemesi, mikrometre kare başına baz çifti cinsinden DNA'nın mutlak yoğunluk tahminlerine izin verir. İhtiyaç duyulan tek önsel bilgi, ölçülen hücre çekirdeğinin toplam DNA içeriğidir.

Gelecekteki deneylerde, mutlak yoğunluk farklılıklarının, epigenetik modifikasyonların immünofloresansı veya Hi-C verileri gibi diğer yöntemlerden elde edilen biyolojik bilgilerle ilişkili olup olmadığını araştırmak ilginç olacaktır. Önceden kaydedilmiş tek görüntüleri bir araya getirerek taranan alanı yeniden oluşturarak başlayın. CellProfiler'ı açın ve cellcycleanalysis.cpproj işlem hattını yükleyin.

İşlem hattının ilk adım görüntülerinde, başvuru görüntüsü de dahil olmak üzere görüntüleri sürükleyip bırakın. Ardından, referans görüntülerin saklanacağı bir konum tanımlayın. Ardından Test Modunu Başlat simgesine ve ardından Çalıştır'a tıklayın.

Analiz edilecek görüntüdeki çekirdeklerin histogramı görüntülendikten sonra, G1, S ve G2 fazları için yoğunluk aralıklarını belirleyin ve bunların boru hattının sonraki filtre nesnesi adımlarına girildiğinden ve bu adımların aktif olduğundan emin olun. Ardından, ardışık düzenin ikinci yarısına devam etmek için Çalıştır düğmesine tekrar tıklayın. Farklı hücre döngüsü aşamalarını, G1, S veya G2'yi temsil eden kaplamalara sahip üç resme bakın ve daha fazla görüntüleme için G1 veya G2'deki çekirdekleri seçin, böylece görüntü çekirdeklerinin baz çiftlerindeki DNA miktarı bilinir.

Hücreleri tek molekül lokalizasyon mikroskobunda yeniden konumlandırın ve FPALM işleminin uygun şekilde yanıp sönmesini sağlayın. İlk olarak, dilim başına yalnızca 500 kare kullanarak seçilen çekirdeğin 3B yığınını kaydedin. Bu, orta bölümdeki nispi DNA miktarının belirlenmesine izin verir ve daha sonra üst yapısını ortaya çıkarmak için çok daha fazla çerçeve ile görüntülenir.

Görüntü serisi alımına 50 milisaniyelik bir pozlama süresi kullanarak başlayın, bu da saniyede yaklaşık 20 karelik bir kare hızıyla sonuçlanır. 200 nanometre adım aralıkları ve ışık optik bölümü başına yalnızca 500 kare ile çekirdekten bir Z yığını alın. Yığın alındıktan sonra, ilk z konumuna dönün ve aynı 50 milisaniye pozlama süresine sahip 50.000 karelik ana veri setini elde edin.

FPALM veri kümesini ImageJ'de açın. Yanıp sönen sinyallerin algılanmasına yönelik ayarları optimize etmek için ThunderSTORM'a ve ardından Analizi çalıştır'a tıklayın. Şimdi Kamera kurulumunu seçin.

Görüntü verilerinin doğru piksel boyutunu, A/D sayısını, kullanılan kameranın kuantum verimliliğini, temel seviyeyi ve EM kazancını girin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Yanıp sönen sinyalleri sığdırarak yerelleştirme koordinatlarını belirlemek için algoritmayı seçin. Görüntü filtreleme bölümünde, B-Spline sırası 3 ve B-Spline ölçeği 2 ile Dalgacık filtresi B-Spline'ı kullanın. Ardından, Moleküllerin yaklaşık lokalizasyonu Yöntemini Yerel maksimum olarak ayarlayın, Tepe yoğunluğu eşiğini ve Bağlantıyı 8 komşuluk olarak ayarlayın.

Moleküllerin alt piksel lokalizasyonu bölümünde, Yöntem olarak PSF tümleşik Gauss'u seçin, Sığdırma yarıçapı px'i 3 olarak ayarlayın, Sığdırma yöntemini Maksimum olasılık olarak seçin ve İlk sigma'yı 1,6 olarak ayarlayın. Sonra tıklayın OK sinyallerin algılanmasını ve görüntünün yeniden oluşturulmasını başlatmak için. Alım farklı görüntü yığınlarına bölünmüşse, yerelleştirme tablolarını ThunderSTORM'da birleştirin.

Bunu yapmak için, açılır pencerede İçe Aktar'a tıklayın. Geçerli tabloya ekle seçeneğinin etkinleştirildiğinden ve tablodaki yerelleştirmelerin geçersiz kılınmasını önlemek için doğru başlangıç numarasının kullanıldığından emin olun. Ardından dosya yolunu seçin ve bir dosyayı birbiri ardına içe aktarmak için Tamam'ı tıklayın.

Ardışık karelerde sinyallerin fazla sayılmasını önlemek için, molekül başına maksimum 20 nanometre mesafe, maksimum 1 kapalı kare ve 0 maksimum kare kullanarak yerelleştirme verilerini birleştirin ve ardından Birleştir'i tıklatın. Veri alt bölümlerini çapraz ilişkilendirerek sapmayı ölçmek ve düzeltmek için Sapma düzeltme menüsünü açın ve okları tıklatın. 3 kutu ekleyin ve Büyütmeyi 5'e ayarlayın.

Ardından Uygula'ya tıklayın, x ve y kaymasını gösteren pencere görünecektir. Her dilim için 500 kare ile önceden kaydedilmiş 3B yığının her dilimindeki DNA içeriğiyle orantılı sinyal miktarını belirlemek için Eklentiler'i, ardından ThunderSTORM'u ve ardından İçe/Dışa Aktar'ı seçin ve yığının ilk dilimi için sonuç tablosunu içe aktarın. 3B yığının diğer görüntü düzlemlerinden gelen sinyallerin aşırı sayılmasını önlemek için, dilimler arasındaki z cinsinden 200 nanometre adım aralığının dışından gelen sinyallerin kaldırılması gerekir.

Histogramı çiz'e basın ve açık Dağıtım iletişim kutusunda z'yi seçin ve Tamam'a basın. Tepe noktasının konumunu belirleyin ve optik adım boyutu 200 nanometre olan sinyalleri seçmek için filtre alanını kullanın. Görselleştirme'ye tıklayın ve Histogramlar seçeneğini seçin, ardından Tamam'a tıklayın. Ortaya çıkan görüntüyü TIFF formatında bir klasöre kaydedin. Tüm dilimleri açın ve Görüntü'yü, ardından Yığınlar'ı ve ardından Yığınlanacak Görüntüler'i kullanarak bunları birleştirin.

Tüm görüntü alanını seçtikten sonra Analiz Et'e gidin, Araçlar'a tıklayın ve ROI Yöneticisi'ni seçin. Ekle'ye tıklayın, ardından Analiz Et'e tıklayın, ardından Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın ve Entegre yoğunluk'u seçin. Şimdi, Daha Fazla seçeneğini seçin, Çoklu Ölçü'yü seçin, Tüm yığınları ölç ve Dilim başına bir satır seçeneğini işaretleyin.

Tamam'a tıkladığınızda sonuçlar görünecektir. Tüm dilimlerin yoğunluklarının toplamı, tüm çekirdeğin DNA içeriği ile orantılıdır, tıpkı tek tek dilimlerin yoğunluklarının tüm genomun fraksiyonlarıyla orantılı olması gibi. 50.000 karelik sinyalleri içeren merkez düzlemin sonuç tablosunu açtıktan sonra, 100 nanometre kalınlığa filtreleyin.

Daha önce gösterildiği gibi ortaya çıkan sinyallerin histogramını oluşturun ve merkez bölümün entegre yoğunluğunu ölçün. MATLAB betiği TS2orte'yi çalıştırarak orta bölümdeki ultrastrüktürel bilgileri içeren büyük ThunderSTORM yerelleştirme tablosunu csv formatından ORTE formatına dönüştürün. m, yerelleştirme tablosunu bir MATLAB matrisine dönüştürür ve mat formatında kaydeder.

LAND-voronoi klasörüne gidin ve coreAlgorithm alt klasöründe voronoicluster dosyasını açın. m ve mutlak yoğunluk hesaplamaları için kullanılan hücre tipine ve hücre döngüsü aşamasına göre DNA içeriğini, tüm çekirdek fraksiyonu DNA'sının gözlemlenen merkez bölümünün fraksiyonunu ve lokalizasyonlarını ve dönüşüm faktörünü ayarlayın. Analizi başlatan komut dosyasını düzenleyin voronoi.m.

Orte yerelleştirme verilerine ve sonuç dosyaları için çıktı klasörüne dosya yolunu ayarlayın. Mozaiklemenin yapılması gereken alanı tanımlayan koordinatları belirtin. Aynı giriş veri kümesi içinde hesaplanacak birden çok alan tanımlayın.

Komut dosyasını çalıştırdıktan sonra, alan dağılımının histogramını ve yoğunluklarını gösteren grafikler içeren diğer dosyalarla birlikte mutlak DNA yoğunluklarını gösteren görüntüyü arayın. m çıktı klasöründeki hesaplanan her bir Voronoi hücresinin yoğunluklarını içeren dosya. 50.000 kareden oluşan FPALM ölçümü, 100 nanometre kalınlığındaki bir orta bölüm içinde tespit edilen 6 lokalizasyonun gücüne 2,68 çarpı 10 ile sonuçlandı.

Yeniden oluşturulan görüntünün lokalizasyon doğruluğu 10 nanometreydi. Çok sayıda lokalizasyon, mutlak DNA yoğunluklarını gösterirken süper çözünürlüklü görüntülemenin kombinasyonuna izin verdi. Ölçülen DNA yoğunluklarının çekirdek boyunca eşit olarak dağılmadığı ve geniş bir dinamik aralığı kapsadığı açıktı.

Çekirdek içindeki daha büyük Voronoi hücrelerini gösteren alanların daha yüksek büyütmeleri, düşük DNA yoğunluklarını gösterirken, daha küçük hücreler yüksek DNA yoğunluklarını gösterdi. G1C3H10T yarım çekirdekte ölçülen DNA yoğunlukları, farklı bir tür ve türün çekirdeği içindeki mutlak DNA yoğunluğu dağılımını gösterdi. Temel organizasyon erken G1 HeLa çekirdeğine benzese de, ayrıca parasentrik heterokromatin kurucu kümelerine sahipti.

Biraz artan nükleer boyuta rağmen G2 çekirdeğinde dramatik bir mimari değişiklik gözlenmedi. TSA ile tedavi edilen HeLa çekirdeği, nükleer topografya ve DNA yoğunluğu açısından dikkate değer farklılıklar gösterdi. Daha yüksek DNA yoğunluğuna sahip adalar gösteren periferik heterokromatin dışında, kromatinin geri kalanı çok daha homojen ve yoğunlaşmamış görünüyordu.