Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır
6 Ekim 2022
Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.
Bu yöntem, bağlama olaylarından gelen sinyali, düşük kaynak kullanımı için görsel olarak algılanabilen veya absorbans tabanlı enstrümantasyon kullanılarak ölçülebilen bir forma yükseltmenin bir yolunu sunar. Bu, aptamerin hedefinin ilgilenilen bir örnekte varlığını belirlemek için nispeten hızlı, tek potlu bir protokoldür. Niceleme isteniyorsa sonuçlar standart bir kalibrasyon eğrisiyle karşılaştırılabilir.
Yetersiz karıştırma olumsuz sonuçlara yol açacağından, çözeltileri aktarırken ve karıştırırken bireyler çok hassas olmalıdır. Ayrıca, arka plan sinyalini en aza indirmek için reaktiflerin ve çözeltilerin kullanılana kadar soğutulmuş halde tutulduğundan emin olun. Bir PCR tüpüne beş birim T4 polinükleotid kinaz ekleyerek ribozim bölünme ürünlerini aktive ederek başlayın.
Ardından, her numune tüpüne bir mikrolitre önceden hazırlanmış 5X ribozim tamponu ekleyin. Özgüllüğü görsel olarak göstermek için, test numuneleri olarak her numune tüpüne 1,5 mikrolitre iki milimolar teofilin veya iki milimolar kafein ekleyin ve her numuneyi beş ila 10 kez pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra, her numune tüpüne hedefe özgü bir aptamerik alan içeren iki mikrolitre 600 nanomolar RNA ekleyin, ardından bileşenleri hızlı bir şekilde karıştırmak için pipetleme yapın.
Şimdi, arka plan sinyalini en aza indirmek için tüpü soğuk bir bloğa yerleştirin. Tüm reaksiyon tüplerini hazırladıktan sonra, her bir numuneyi oda sıcaklığında tam olarak üç dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, numune tüplerini derhal buza geri döndürün.
Her numune tüpüne 3,5 mikrolitre nikaz polimeraz enzim karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, her bir numune tüpüne şablon nükleotidleri ve reaksiyon tamponu içeren 31,5 mikrolitre EXPAR reaksiyon karışımı ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, hazırlanan numuneyi bir zamanlayıcı kullanarak beş dakika boyunca 55 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyondan sonra numune tüplerini derhal buza geri getirin. Renk gelişimi için her numune tüpüne iki mikrolitre hemin çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, her bir numune tüpüne ticari olarak temin edilebilen TMB çözeltisinden 58 mikrolitre ekleyin, iyice karıştırın ve renk gelişimi için inkübe edin.
Numuneleri kalitatif olarak gözle okuyun veya makalede açıklandığı gibi bir absorbans plakası okuyucu kullanarak sonuçları ölçün. Optimize edilmiş yapı, 30 dakika içinde 500 nanomolar teofilin kadar az tanıyabilir. Hedefe maruz kalan numune preparatları mavi bir renk üretirken, hedef içermeyen numuneler renksiz kalır.
30 dakikalık renk gelişiminden sonra A450'de ölçülen sinyalden standart bir eğri hazırlandı. Kuluçkaları gerçekleştirmezken numuneleri buz üzerinde tutmak önemlidir, çünkü optimize edilmiş RNA bile hala düşük bir arka plan aktivite seviyesi sergileyecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, teofilin gibi hedeflerin saptanması için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı bir eksponansiyel amplifikasyon analizini göstermektedir. Protokol; numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimini kapsamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Analitik Kimya
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- Aptamerler, belirli hedeflere bağlanabilen kısa, tek zincirli RNA veya DNA molekülleridir.
- Sinyal amplifikasyonu, düşük bolluktaki hedeflerin saptanması için kritik öneme sahiptir.
- Görsel tespit yöntemleri, düşük kaynaklı ortamlar için faydalı olabilir.
- Doğru sonuçlar elde etmek için reaktiflerin hassas şekilde uygulanması esastır.
Çalışmanın Amacı
- Kafeine karşı teofilin tespiti için hızlı bir yöntem geliştirmek.
- Sinyal amplifikasyonu için tek kaplı (one-pot) bir protokol sağlamak.
- Bir kalibrasyon eğrisi kullanarak sonuçların miktar tayinine olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ribozim kesim ürünlerinin T4 polinükleotid kinaz ile aktivasyonu.
- Bağlanma olaylarının görsel olarak tespiti.
- Absorbans tabanlı cihazlar kullanılarak nicelleştirme.
- Arka plan sinyalini minimize etmek için reaktiflerin dikkatli bir şekilde karıştırılması ve soğutulması.
Temel Sonuçlar
- Bu yöntem, örneklerde teofilin tespitine olanak sağlar.
- Sonuçlar görsel olarak yorumlanabilir veya nicelleştirilebilir.
- Başarılı sonuçlar için çözelti hazırlamadaki hassasiyet kritik öneme sahiptir.
- Uygun reaktif yönetimi ile arka plan sinyalleri minimize edilebilir.
Sonuçlar
- Aptamer tabanlı analiz, hedef tespit için hızlı ve etkili bir yöntemdir.
- Kısıtlı imkanlara sahip ortamlardaki çeşitli uygulamalara uyarlanabilir.
- Gelecekteki çalışmalar ek hedefleri ve protokolün optimizasyonunu araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
İzotermal eksponansiyel amplifikasyona dayalı aptamer bazlı tespit sistemleri, erken keşif iş akışlarında hedef doğrulaması için hızlı, hassas ve görsel olarak yorumlanabilir çıktılar sunar. Bu üç aşamalı G-kuadrupleks amplifikasyon protokolü, hem kalitatif hem de kantitatif okumalara olanak tanıyarak analiz geliştirme ve tarama kırılma noktalarında güçlü karar verme süreçlerini destekler. Bu yaklaşım, hedef etkileşimi ve özgüllüğe yönelik öngörü güvenini artırarak, portföy önceliklendirmesini ve sonraki analiz hazırlıklarını doğrudan etkiler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Aptamer özgünlüğü kullanılarak moleküler tanıma olaylarının doğrudan sorgulanmasına olanak tanır.
- Görsel olarak tespit edilebilir çıktılar aracılığıyla hedef bağlanmasının fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Mekanistik risk azaltma için hedef etkileşiminin hızlı değerlendirmesini kolaylaştırır.
- Birbirine çok yakın analitleri ayırt ederek hedef seçiciliğine olan güveni artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Tekrarlanabilir analiz kurulumu için standartlaştırılmış, tek aşamalı (one-pot) bir protokol sağlar.
- Güvenilir bileşik değerlendirmesi için absorbans ölçümü aracılığıyla kantitatif çıktılar sunar.
- Minimum enstrümantasyon gereksinimi ile örneklerin hızlı şekilde taranmasına olanak tanır.
- Analiz standardizasyonu için kalibrasyon eğrisi tabanlı kantifikasyonu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Aptamer tasarımıyla desteklendiğinde, hastalıkla ilişkili biyobelirteçlere uyarlama potansiyeli sunar.
- Ölçeklenebilir deteksiyon formatları aracılığıyla keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği sağlar.
- Optimize edilmiş protokollerle arka plan sinyalini minimize ederek yalancı pozitif riskini azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu aptamer-EXPAR sistemi, moleküler tanımadan kantitatif analiz geliştirme sürecine bir köprü kurarak, erken keşiften öncü bileşik tanımlama sürekliliği içerisine yerleşmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Hedef varlığını ve özgüllüğünü doğrulayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmalarını destekler.
- Tarama: Yüksek çıktılı veya kaynakların sınırlı olduğu ortamlar için uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için absorbans tabanlı ölçüm ve standart eğri oluşturulmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Aptamer özgüllüğü belirlendiği takdirde biyobelirteç saptaması için uyarlanabilir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Protokol modülerliği, aptamer bölgelerinin değiştirilmesi yoluyla yeni hedeflere uyarlanmaya izin verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörüsel güveni artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Hızlı, standartlaştırılmış ve ölçeklenebilir bir protokol ile iş akışlarını optimize eder.
- Stratejik Değer: Daha hızlı devam/tamam kararlarına ve sermaye açısından verimli assay geliştirmeye olanak tanır.
- Portföy Etkisi: Güçlü ve kantitatif tespit verileri sağlayarak riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Aptamer tasarımı ve nükleik asit işlemleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kantitasyon için temel moleküler biyoloji enstrümantasyonuna ve absorbans plaka okuyucularına erişim gereklidir.
- Arka plan sinyalini minimize etmek için hassas reaktif kullanımı ve sıcaklık kontrolü gereklidir.
- Protokol, aptamerik domain modifiye edilerek farklı hedeflere uyarlanabilir.
- Spesifisiteyi sağlamak ve yalancı pozitifleri minimize etmek için dikkatli optimizasyon gereklidir.
