Sinaptik Bileşenlerin Murin Beyinden İzolasyonu için Hücre Altı Fraksiyonasyonu

Sinapslar beynin temel hesaplama birimleridir. Sunulan yöntem, sinapsları ve moleküler süreçlerini incelemek ve ayrıca çeşitli beyin bozukluklarında nasıl değiştirilebileceklerini anlamak için basit ve değerli bir araçtır. Bu teknik, beyinden izole edilen sinaptozom yapılarının fraksiyonasyonunu içerir.

Bu, araştırmacının sinapsta bölümlere ayrılabilecek etkileri yakalamasını sağlar. Spesifik proteinlerin dağılım seviyeleri ve aktivitesi de subsinaptik çözünürlükle analiz edilebilir. Bu prosedür, her şey yolunda giderse bireysel bir araştırmacının tamamlaması yaklaşık 11 saat sürer.

Bu tekniği hiç uygulamamış bir birey, adımlara aşina olmayan biri için doğal olarak biraz daha uzun süreceğinden, bu prosedürün uzunluğu konusunda zorluk çekebilir. Bu deney gününün uzunluğu nedeniyle, diseksiyonları, numunelerin buz üzerinde gerekenden daha uzun süre ayarlanmamasını sağlamak için hızlı doku toplamayı kolaylaştırmanıza yardımcı olabilecek bir ortakla yapmanızı şiddetle tavsiye ederiz. Ayrıca, gerektiğinde her şeye kolayca erişilebilmesi için bu denemeyi çalıştırmadan bir gün önce tamponlar ve tezgah üstü malzemeler hazırlamanızı öneririz.

Bu özellikle toplama tüpleri için geçerlidir. Bu prosedürün sonunda toplam 11 hücre altı fraksiyonun çoklu alikotları toplanacaktır. Bu nedenle, bu tüplerin önceden açıkça etiketlenmesi gününüzü çok daha kolay hale getirecektir.

Başlamak için, kafa kesme insizyonunda cildin altına peri kraniyal derinliğe ince makas yerleştirin ve kafa derisini kafatasından geri çekmek için burun içi dikişe kadar orta sagital bir kesi yapın. Oksipital bölgeden her bir zamansal yöne doğru çalışarak, kafatasının dış yüzeyini her bir dış akustik meatusun ötesinde ortaya çıkarmak için fasyayı ve kası kesin. Kafatasının kafa derisini ve rostral yönünü baskın olmayan elle sabitleyin ve diğer elinizle omuriliğin görünür olduğu foramen magnumunun kaudal tarafına iki milimetre ince makas yerleştirin.

Makas intraparietal kemiğin iç yüzeyine ulaşana kadar orta hat kesisi yapın. Makasların açısını değiştirin, böylece bıçaklar kafatasının sırt yüzeyine paralel olarak çalışır. Sagital ve interfrontal sütürleri rehber olarak kullanarak midsagital insizyonu parietal ve frontal kemiklerden rostral olarak ilerletmeye devam edin ve insizyonu internazal sütürün hemen ötesinde sonlandırın.

Daha sonra, burun kemiğine üç milimetrelik dik bir kesi yapın, internazal sütüre rostral, makası kafatasına dik olarak yerleştirin ve her bıçak burun premaksiller sütürüne yerleştirilerek ve bir tane bile kesilmiş hale getirin. Rostral yönü güvence altına alırken, kafatasını beyinden yavaşça kaldırmak için bir çift dokulu forseps bir tarafını kullanın ve ardından yanal ve ventralal olarak kaldırın. Gerektiğinde orta hat boyunca, ardından tüm beyin yüzeyi açığa çıkana kadar diğer yarımküre için tekrarlayın.

Kavisli forseps veya ince bir spatula kullanarak beynin rostral tarafını yavaşça kaldırın. Kafatasından eksizyonu tamamlamak için optik ve kraniyal sinirleri kesin. Bir buz banyosuna yerleştirilen bir cam downs homojenizatörü kullanarak beyinleri homojenize edin, 500 rpm'de 12 yukarı aşağı geçiş.

Dokunun tam homojenizasyonunu sağlamak için her aşağı vuruşta kısa bir süre duraklayın. Toplam beyin homojenatını 14 mililitrelik yüksek hızlı yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın ve S1.transfer S1 olarak adlandırılan süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne elde etmek için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 G'de döndürün, peleti atın. Bibinkoninik asit testi için iki adet beş mikrolitrelik S1 alikotu ve batı lekesi için iki adet 100 mikrolitrelik S1 alikotu alın.

Sinaptik somal süpernatan veya S2 ve ham sinaptozom pelet veya P2'yi elde etmek için S1'i 9.000 G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Biskinkoninik asit testi için iki, 10 mikrolitre S2 alikotu ve batı lekesi için iki adet 500 mikrolitre S2 alikotu alın. Aliquots'u elde ettikten sonra süpernatantı atın. dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 9.000 G'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatant S2'yi elde edin ve sinaptozomu yıkayın, P2' Süpernatantı atın ve P2'in üç mililitre tamponunu yeniden askıya alın A.Esas olarak mitokondri içeren peletin altındaki koyu kırmızı kısmı yeniden askıya almaktan kaçının.

Biskinkoninik asit testi için iki adet 20 mikrolitre P2' alikotu ve batı lekesi için iki adet 100 mikrolitrelik P2' alikotu alın. Yıkanmış sinaptozomun hipotonik lizisi için, P2'yi yeniden askıya almak için dokuz hacim soğutulmuş tampon B ekleyin ve sinaptozomu bir bardakta homojenize edin homojenleştirin. Numuneleri 50 mililitrelik kapaklı konik santrifüj tüplerine aktarın ve 15 dakika boyunca dört santigrat derece soğuk odada bir tüp tabanca üzerinde döndürün.

Lizis süpernatantı veya LS1'i ve sinaptozom membranları veya LP1'i içeren lizis peletini elde etmek için lizsed P2'at 25.000 G'yi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüj edin. Biskinkoninik asit testi için iki, 50 mikrolitre LS1 alikotu ve batı lekesi için iki adet 400 mikrolitre LS1 alikotu alın. LS1'i ultra santrifüjleme için kapaklı bir santrifüj tüpüne aktarın.

LS1'i sabit açılı bir ultra santrifüj rotorunda 100.000 G'de 60 dakika boyunca dört santigrat derecede sinaptik sitosol süpernatan veya LS2 ve sinaptik vezikül pelet veya LP2 elde etmek için santrifüj yapın. LP2'yi 500 mikrolitre tampon A'da yeniden askıya alın ve 23 gauge iğne ve bir mililitrelik bir şırınga şeffaf LP iki kullanarak nazik tritürasyon ile. Bibinkoninik asit testi için iki, 10 mikrolitre LP2 alikotu ve batı lekesi için iki, 250 mikrolitre LP2 alikotu alın.

Yaklaşık 30 mililitre LS2'yi 10 miliDalton kesimli santrifüjlü filtre ünitelerine aktarın ve LS2'yi dört santigrat derecede bir saate kadar 5.000 G'de döndürerek yaklaşık 0,5 mililitreye konsantre edin. Biskinkoninik tahlil için iki, 10 mikrolitre konsantre LS2 alikotu ve batı lekesi için iki, 250 mikrolitre konsantre LS2 alikotu alın. LP1'i bir mililitre tampon B'de yeniden askıya alın ve bibinkoninik asit testi için iki, 10 mikrolitre LP1 alikotu ve batı lekesi için iki adet 50 mikrolitre LP1 alikotu alın.

Kalan LP1'i 7,5 mililitrelik bir son hacme ve tampon B ve tampon C ile 1,1 molar'lık bir son sakkaroz konsantrasyonuna ayarlayın.Ardından, yeniden askıya alınan LP1'in 7,5 mililitresini 14 mililitrelik bir ultra santrifüj tüpüne aktarın. LP1'i 3,75 mililitre tampon D ile dikkatlice yerleştirin ve çözeltinin üstünü bir kalemle işaretleyin. Daha sonra yaklaşık 1.25 mililitre tampon A ile örtün, benzer şekilde çözeltinin üstünü bir kalemle işaretleyin.

Ultra santrifüjleme için tüpleri hacme göre değil, ağırlığa göre dengeleyin ve A tamponunun damla damla eklenmesiyle 10 miligram içinde ekleyin. Sallanan bir kova ultra santrifüj rotorunda dört santigrat derecede 2,5 saat boyunca 48.000 G'de santrifüj yapın ve her bir sakkaroz arayüzünün farklılığını ve fraksiyonasyonun başarısını belgelemek için sağlam gradyanların görüntülerini elde edin. 320 milimolar sakarozun yüzeysel tabakasını dikkatlice çıkarın ve 800 mikrolitrelik bir hacimde 320 milimolar, 855 milimolar sakkaroz arayüzündeki miyelin fraksiyonunu geri kazanın.

Pipet, tüm fraksiyonun toplanmasını sağlamak için tüplerin duvarından dairesel bir şekilde yukarı doğru pipetleyin. Daha sonra SPM fraksiyonunu 1000 mikrolitrelik bir hacimde 855 milimolar, 1.1 milimolar sakkaroz arayüzünde geri kazanın. Kalan sakkarozu dikkatlice aspire edin ve 200 mikrolitre tampon B'de yeniden askıya alarak mitokondriyal peleti geri kazanın.SPM fraksiyonunu iki hacimli tampon B ile seyreltin ve ardından 3.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde sabit açılı bir rotorda santrifüj yapın.

Süpernatantı atın ve SPM peletini 250 mikrolitrelik son bir hacim için tampon A'da yeniden askıya alın. Bikinkoninik asit testi için iki, beş mikrolitrelik SPM alikotu alın ve kalan SPM'yi batı lekesi için ikiye bölün. Sinaptozomun elektron mikroskobu görüntüleri bu şekilde gösterilmiştir.

Hem sinaptik öncesi hem de sonrası sinaptik vezikülleri ve bir mitokondrideki sinaptik vezikülleri içeren bir sinaptozom burada gösterilmiştir. Fraksiyon saflığı belirteçlerini değerlendirmek için hücre altı fraksiyonların immünoblot analizi yapıldı. Başlangıçtaki tüm beyin homojenatı ile karşılaştırıldığında, analiz, sinaptik plazma membran fraksiyonunda n-kadherin, sinaptik sitosolde alfa sinüklein, sinaptik vezikül fraksiyonunda sinaptofizin ve miyelin fraksiyonunda miyelin bazik proteininin zenginleştiğini ortaya koymuştur.

Fraksiyon saflığı belirlendikten sonra, kantitatif immünoblotlama, ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonunu belirlemek veya genotipler veya tedaviler arasındaki protein dağılımındaki farklılıkları sorgulamak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, bozulmamış sinaptozomun toplanabilmesi için deterjansız cam eşyalar kullandığınızdan emin olun. Ayrıca, net arayüzler elde ettiğinizden emin olmak için sakkaroz gradyanlarını hazırlarken dikkatli olun.

Bu, sinaptik plazma membran fraksiyonunu başarılı bir şekilde izole etmenizi sağlayacaktır. Elektron mikroskobu, immünoblotlama, proteomik ve diğer moleküler yöntemler gibi sinaptik fraksiyonların kalitesine yardımcı olmak için çeşitli yapısal ve fonksiyonel analizler yapılabilir. Sinaptozomun metabolik canlılığına yardımcı olmak için nörotransmitter salınımı veya enzimatik testler de yapılabilir.

Sinaptozom yapılarının izolasyonu, sinaps fonksiyonunun ve kompozisyonunun analizi için paradigma değiştiren bir teknikti. Nörodejenerasyonda erken sinaptik disfonksiyonu gördüğümüz için, moleküler değişikliklerin sinaps düzeyinde dikkatli bir şekilde diseksiyonu, bu bozuklukların moleküler mekanizmalarını keşfetmemize yardımcı olacaktır.