Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, kesikli bir sükroz yoğunluk gradyanı kullanarak fare beyin korteksinden translasyonel olarak aktif sinaptoneuro zonlar hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle fare kortekslerinin toplanıp homogenize edilmesi ve ardından homogenatın santrifüj edilmesiyle gerçekleştirilir. Bunun ardından, santrifüj edilen homogenat veya süpernatan, önceden hazırlanmış sükroz gradyanlarına uygulanır.

Son adım, sinaptozom fraksiyonunu santrifüj ederek toplamaktır. Nihayetinde, western blot analizi ve S 35 metiyonin inklüzyon deneyleri, sinaptozom fraksiyonunun sinaptik olarak zenginleşmiş ve translasyonel olarak aktif olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin santrifüjasyon ve filtrasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları; ilk olarak, yoğunluk gradyanları kullanılarak mekanik hasarın önlenmesi ve ikinci olarak, kullanılan bileşenlerin hücreler üzerinde düşük toksisiteye sahip olmasıdır.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, zamanlamanın kilit bir rol oynaması nedeniyle bu protokolde zorluk yaşayabilirler. Korteksler toplandıktan sonra prosedür hızla tamamlanmalıdır. Prosedüre başlamak için, eşlik eden makalede açıklandığı şekilde GM tamponuna uygun miktarlarda SIP ekleyerek %3, 10, 15 ve 23'lük gradyan katmanlarını hazırlayın ve iyice karıştırın.

Her bir %15, %10 ve %3 izosmotik perol çözeltisinden iki mililitre pipetleyerek kapaklı Beckman santrifüj tüplerine döküp gradyan tabakalarını oluşturun. P 1000 pipet kullanarak, tabakalar arasında hiçbir karışma olmadan arayüzün net bir şekilde ayırt edilebilir olması gerekir. Gradyanları kullanmadan önce en az 20 dakika boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta saklayın.

Bu prosedüre başlamadan önce, beraberindeki makalede açıklandığı şekilde diğer gerekli solüsyonları hazırlayın. P 13 ile P 21 yaşındaki fareyi ötanize edin ve ense ile baş bölgesine %70 ethanol püskürterek diseksiyona hazırlayın. Ardından, kafatasının tabanındaki omuriliği kesmek için bir çift keskin makas kullanın.

Ardından, kafatasının üst kısmındaki deriyi çıkarın. Kafatasını lateral olarak parietal kemik ile inter parietal kemik arasından veya cerebrum ile korteks bölgeleri arasından kesin. Bundan sonra, kafatasını sagittal sütür boyunca tabandan buruna doğru kesin.

Bu adımda, her bir hemisferi yanlara doğru çekerek yumuşak parietal kemiği dikkatlice çıkarın. Ardından, korteksi sıyırmak için spatulayı beyne, serebellumun üzerine yerleştirin. Korteksi buz gibi soğuk GM tamponuna yerleştirin ve daha fazla korteks toplamak için prosedürleri tekrarlayın.

Şimdi korteksleri buz soğukluğundaki GM tamponu ile durulayın. Ardından iki korteksi, beş mililitre soğuk GM tamponu içeren cam bir homogenizatöre aktarın. Korteksleri önce gevşek havan olan havan A ile beş ila 10 darbe, ardından sıkı havan olan havan B ile beş ila 10 darbe uygulayarak nazikçe homogenize edin.

Vuruş sayısı, kullanılan homojenizatöre bağlı olarak değişiklik gösterir. Homojenize edilen örneği 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. 1000 kez santrifüjleyin.

Hücresel kalıntıları ve çekirdekleri çöktürmek için Allegra six KR santrifüjünde, dört degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca Gravity uygulanır. Her bir per veya sukroz gradyanı için iki milliliters süpernatant eklenir; her bir bütün korteks için bir gradyan kullanılır ve tüpler kapatılır. Ardından, Beckman J 2 21 santrifüjünde, sabit açılı rotorda, dört degrees Celsius'ta beş dakika boyunca 32, 500 times gravity hızında santrifüj edilirler.

İşlem tamamlandığında, uygun adaptörler kullanılarak gradyan, güçlü bir SN bandı vermelidir; SN bandının üzerindeki çözeltiyi pipetle çekip atın. Bir cam pasta pipet kullanarak, %15 ile %23 arayüzündeki SN bandı pipetle çekilir; bir gradyan genellikle yaklaşık 0,9 ila 1,1 mililitre SN verir. Ardından, bunu konik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.

Ardından, SNS'nin tuz konsantrasyonunu 10 kat yoğunluktaki stimülasyon tamponunun 1/10 hacmini ekleyerek ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, final konsantrasyonu 12 nano molar olacak şekilde 1000 kat yoğunlukta kalsiyum klorür ekleyin. Son olarak, spesifik olmayan eksitasyonu baskılamak için final konsantrasyonu bir mikromolar olacak şekilde bir milimolar TTX stok çözeltisi ekleyin.

Bir sonraki adım, SNS'nin protein translasyon çalışmaları gibi uygun alt uygulamalarda kullanılmasıdır. Diğer uygulamalar için SN lizatı, Pierce SDS page örnek hazırlama kiti kullanılarak temizlenebilir veya konsantre edilebilir. SNS'nin protein konsantrasyonu, mikro BCA protein analiz kiti kullanılarak belirlenebilir.

Burada altı bant veya fraksiyon örneği verilmiştir. Fare korteksi homojenize edilip süreksiz perkol sukroz gradyanlarında ayrıştırıldığında, zenginleştirilmiş SNS'ler %23 ile %15 ara yüzeyindeki beşinci bantta yer almıştır; bu bant çıkarılmış ve elektron mikroskobu ile incelenmiştir. Bozulmamış sinaptik veziküller ile presinaptik ve postsinaptik elementlerin korunumuna dair bir örnek, buradaki western blot görüntüsünde gösterilmiştir.

Sürekli olmayan bir sükroz gradyanından elde edilen SN bandında sinaptik belirteçlerdeki artış ve safsızlıklardaki azalma, glutamat eklenmesi üzerine S 35 metiyonin inklüzyonundaki artışın de novo protein sentezinden kaynaklandığını doğrulamak için gösterilmiştir. Bir protein sentezi inhibitörü olan 40 micromolar anesa mycin eklenmiştir. Bu şekil, bazal seviyelerle karşılaştırıldığında, glutamat varlığında veya yokluğunda anso mycin mevcudiyetinde S 35 metiyonin inklüzyonundaki belirgin azalmayı göstermektedir.

Böylece, süreksiz peral sakkaroz gradyanları, protein translasyonunu incelemek için kullanılabilecek, oldukça aktif ve nispeten saf SNS'leri hızlı bir şekilde üretir. Bu şekil, süreksiz per çekirdek sakkaroz gradyanındaki beşinci bandın en yüksek düzeyde de novo protein sentezi içerdiğini göstermektedir. Karşılaştırma amacıyla, homojenize edilmiş korteksin azalan gözenek boyutuna sahip bir dizi filtreden geçirilmesi ve ardından süreksiz per çekirdek sakkaroz gradyanında santrifüjlemesiyle hazırlanan SNS, süreksiz peral sakkaroz gradyanı yöntemiyle hazırlanan SNS'ye göre daha fazla parçalanmış membran ve daha az bütün SNS içerir. Süreksiz peral sakkaroz gradyanı yöntemi kullanılarak hazırlanan SNS'lerin, filtrasyon yöntemiyle hazırlanan SNS'lere göre daha fazla de novo protein sentezi aktivitesi içerdiği görülmektedir.

Genç farelerden hazırlanan SNS'lerin, yaşlı farelere kıyasla daha yüksek translasyonel aktiviteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, fare kortekslerini homojenize ederek, homojenatı salınımlı kova rotorunda santrifüj ederek, süpernatantı sabit açılı bir rotorda sükroz gradyanı üzerinden santrifüj ederek ve ardından ortaya çıkan sinaptik nörozon bandını toplayarak translasyonel olarak aktif sinaptik nörozonların nasıl izole edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olacaksınız.