Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Floresan mikroskobu ile hızlandırılmış görüntüleme, hücresel ve hücre altı seviyelerde büyüme ve gelişmenin dinamik değişikliklerinin gözlemlenmesini sağlar. 3D hızlandırılmış görüntüleme için bu basit protokol, uzun bir süre boyunca hücre duvarı dinamiklerini doğrudan inceleyebilir. Bu protokol, hücre duvar kalınlığının dinamiklerini işaretlemek için kalkoflor boyası kullanır ve bu nedenle bir floresan proteininin dönüşümünü gerektirmez.

Kalkoflor sinyalleri kararlıdır ve bir haftadan fazla sürebilir. Bu yöntem hücre duvarları içeren basit yapılara sahip diğer birçok sisteme uygulanabilir ve çiçekli bitkilerde olduğu gibi kalkoflor ile boyanabilir. Bu protokolde, bu boya tüm hızlandırılmış görüntüleme işlemi sırasında ortam içinde karıştırıldığında kalkoflor sinyalleri kararlıdır.

Başlamak için, yedi günlük yosun dokusunu 20 mikrolitre sterilize su içeren 1,5 mililitrelik bir mikro tüpe dağıtın. Vahşi tip için protonemata'yı ayırmak için forseps kullanın. ggb mutantı için, protonemata'yı AP-1000 pipet kullanarak ayırın.

Mikrotüpe 10 mikrolitre sterilize edilmiş kalkoflor-beyaz ekleyin ve boyama için tüpü kaputta iki dakika dik bırakın. Lekelemeden hemen sonra, bitkileri bir P1000 pipetle beş kez pipetleyerek BCDAT ortamı içeren 200 mikrolitre soğutulmuş BCDATG ile karıştırın ve karışımı 27 milimetrelik bir cam taban kabına aktarın. Numunelerle birlikte 200 mikrolitre BCDATG'nin, görüntüleme sırasında numunelerin objektif çalışma mesafesi içinde olması için ince bir film tabakası üretmek üzere 27 milimetrelik cam alt kabın yüzeyine eşit olarak dağıtıldığından emin olun.

Oda sıcaklığında iki dakika katılaştıktan sonra, ince tabakayı üç mililitre soğutulmuş BCDATG ile örtün ve tekrar katılaşması için 10 dakika bekletin. Çanağın alt kısmında, her biri paralel ve dik yönlerde dokuz çizgi çizin ve satırları A'dan H'ye karakterlerle ve sütunları bir ila sekiz arasında sayılarla işaretleyin. Her karedeki konumları işaretlemek için üst, alt, sağ, orta ve sol kullanın.

Örneğin, bir bitki ikinci sırada, altıncı sütunda bir karede ise ve karenin sol üst kısmına yerleştirilmişse, bu bitkiye sol üst kısımda b6 adı verilir. Cam alt kabı, üç güne kadar her gün hızlandırılmış görüntülemeye tabi tutulmadan önce bir ila iki gün boyunca beyaz ışık altında yerleştirin. 3B görüntüleri yeniden oluşturmak için ND2 dosyasını açın ve birim'i tıklatın.

Hücre duvarını sıfır gününde, birinci günde, üçüncü günde ve dördüncü günde yeniden yapılandırın. Her görüntüyü çektikten sonra, cam bazlı tabağı tekrar büyüme odasına koyun. Çapraz duvarlardaki dinamik değişiklikler, vahşi tipte kalkoflor-beyaz boyama ve ggb mutantları ile gösterilmiştir.

ggb mutantları için, her görüntünün altındaki beyaz kesikli çizgiler, genişleyen hücrelerdeki kırık yüzey hücre duvarını ve turuncu çizgiler ggb'deki hücre duvarı yüzeyinin altındaki hücreleri gösterir. Kalkoflor-beyaz sinyaldeki farklılıklar, hücrelerin yüzey konumlarında tespit edilebilir ve ggb mutantlarında veya vahşi tipte yeni dallanma bölgelerinde hücre genişlemesini gösteren daha az yoğun lekeli bölgeler tespit edilebilir. Yabani tip ön kültür için, beş gün boyunca yukarıdan zayıf kırmızı ışıkta olan bitkilerin, protonemata'nın fototropik tepkilerini indüklemesi gerekir, böylece bitkiler bulaşıkların dibine tutturulabilir ve bitkiler görüntüleme sırasında objektif yukarı çalışma mesafesi içinde ortaya çıkabilir, çünkü kalkoflor-beyaz, mikrosfer gibi diğer boyalarla birlikte kullanılabilir.

Hücre genişlemesi hakkında ek bilgiler de incelenebilir. Bitki hücre duvarının dinamiği, büyüme ve gelişmeyi verimli bir şekilde yapmak ve çevresel sinyale yanıt vermek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, hücre duvarı sinyallerindeki değişikliklerin doğrudan bölünmesine ve entegre edilmesine izin verir.