Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, floresan etiketli proteinlerin bitki hücre yüzeyleri üzerindeki hareketini değişken açılı epi floresan mikroskobu ile gözlemlemektir. Bu damar, proteinin plaka hücre yüzeylerinde nasıl çalıştığı gibi bitki hücre biyolojisi alanında ilerlememize yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, işleme başlamadan önce floresan atak proteinlerinin gerçek zamanlı dinamiklerini görselleştirmemize izin

Mikroskobun lazer merkezlemesini ve odaklanmasını üreticinin talimatlarına göre kalibre edin. Ardından, mikroskopi odası tavanının merkezini bulmak için objektif lenssiz bir ışık yolu kullanın ve konumu renkli bir conta ile işaretleyin. Ardından, tavanı objektif bir mercekle aydınlatın ve aydınlatılan bölgeyi orta konuma getirin.

Ardından lazeri odaklayın ve lazerin konumunu tavanın ortasına göre ince ayarlayın. Lazerin merkezlenmesi ve odaklanması, başarılı değişken açılı epi koku mikroskobu veya VAEM gözlemi için çok önemlidir. Kullanıcılar, bir deneye başlamadan önce mikroskop şirketinden profesyonel bir personel tarafından eğitilmelidir.

Mikroskop hazır olduğunda, 76 x 26 milimetrelik bir cam slaytın ortasına 30 mikrolitre bazal tampon dağıtın. Ardından, yedi günlük bir fideden bir co leadin'i çıkarmak için diseksiyon makası kullanın ve co leadin'i gözlem tarafı yukarı bakacak şekilde bazal tampon damlası üzerinde yüzdürün. Daha sonra, 18 x 18 milimetrenin merkezine 30 mikrolitre bazal tampon ekleyin.

Camı örtün ve kapak camını ters çevirin. Nazikçe yüzey gerilimi, kapak camını bir kenarında cımbızla tutarak damlanın düşmesini önleyecektir. Karşı kenarı, tampon ortak girişin üzerinde olacak şekilde cam sürgünün üzerine yerleştirin.

Ardından kapak camının kenarını slayt üzerinde tutun. Damlanın konumunu, doğrudan olein numunesinin üzerinde olacak şekilde ayarlayın ve kapak camını bırakın. Hava kabarcığı yoksa, fazla tamponu silmek için tüy bırakmayan mendiller kullanın ve preparatı hemen mikroskoba aktarın.

Parlak alan aydınlatmasını kullanarak, gözlem için hücreleri seçin. Ardından, floresan proteinin gözlemlenebildiğini onaylayın ve hücre yüzeyindeki Z ekseni konumunu ayarlamak için epi floresan aydınlatmasını kullanın. VAEM gerçekleştirmek için, lazer ışınının giriş açısını eğmek için kontrol kutusunu kullanın.

Canlı görüntüyü dikkatlice izlerken yavaş yavaş. Başlangıçta, görüntü bulanık görünecektir. Lazer açısı arttıkça, VAEM görüntüsü daha az bulanık hale gelecek ve sonunda net bir görüntü üretecektir.

Bu noktada, lazer açısını artırmayı bırakın. Şimdi iyi. Daha iyi bir görüntü elde etmek için lazer giriş açısını ayarlayın, optik ve görüntü sensörü parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.

Daha sonra ticari mikroskop yazılımını kullanarak, çok sayfalı bir TIFF görüntü dosyası olarak bir film elde edin. Burada film, STA model hücrelerinin yüzeyinde yanıp sönen GFP etiketli noktaları gösteriyor. Fiji kullanarak GFP etiketli DOT kalış süresini ölçmek için dosya açma menüsüne gidin ve alınan çok sayfalı bahşiş dosyasını açın.

İlgilenilen tarafa bir çizgi yerleştirmek için düz çizgi seçim aracını kullanın. Ardından, bir grafik görüntüsü oluşturmak için görüntü yığınları dinamik çözünürlük dilimi eklentisini kullanın. Çizgi değiştikçe, grafik görüntüsü dinamik olarak değişecektir.

Görüntüyü dosyanın altında bir TIFF dosyası olarak kaydedin, tiff olarak kaydet menüsünde. Ardından gürültü azaltma işlemi gerçekleştirmek için işlem filtreleri Gauss bulanıklığı menüsüne gidin ve kronograf görüntülerine bir Gauss filtresi uygulayın. Sigma yarıçapı parametresi gerektiği gibi ayarlanmalıdır.

Görüntü ayarlama eşiği aracını kullanarak, sinyal bölgelerini eşikleyerek bölümlere ayırın ve ayar ölçümlerini analiz et menüsünü açın. Ardından, mümkün olan en az piksel sayısını seçerek ayar ölçüleri penceresindeki sınırlayıcı dikdörtgeni kontrol edin. Ardından analiz altında, parçacıkları analiz et menüsü bulunur.

İlgilenilen noktanın Y eksenine karşı zamanını ölçün ve veri değerlerini görüntülemek için görüntüleme sonuçlarını ve yönetici kutularına eklemeyi kontrol edin. Son olarak, sonuç tablosu menüsü altında, dosyayı seçin, farklı kaydedin ve uygun analiz yazılımını kullanarak nokta görüntü sürelerinin veri kümesini işleyin. Burada, 185 GFP devriyesinin sekizinci sırada yer alan 12 bağımsız yardımcı hücreden bir nokta ile chm grafiği analizi ile ölçülen kalma süreleri grafikte gösterildiği gibi gösterilmiştir.

Takılan yoğunluk işlevi, GFP devriyesi bir noktanın çoğunun, yaklaşık 3,5 saniyelik bir tepe noktası ile iki ila 10 saniye arasında bir yan hücrede yerleşik olduğunu ortaya koydu. Bu, ikincil hücre yüzeyindeki proton pompalarının hızlı bir ekzositoz endositozunu önerir. Bu videoyu çalıştıktan sonra, değişken açılı epi floresan mikroskobu kullanarak bitki hücre yüzeyindeki ary tipi protein dinamiklerini nasıl görselleştireceğinizi ve ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.