Floresan Görüntüleme Kullanılarak Jurkat Eksprese Eden Kimerik Antijen Reseptörünün Hızlı İn Vitro Sitotoksisite Değerlendirmesi
27 Ekim 2023
Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.
CAR T hücreleri, insan klinik deneylerinde daha iyi yanıtlar elde etmek için sürekli olarak geliştirilmektedir. Bunu, en iyi sonucu veren kombinasyonları taramak için floresan görüntüleme kullanmak gibi tarafsız bir yüksek verimli yöntem kullanarak laboratuvarımızda değerlendirmenin yollarını belirliyoruz. Hücre dışı ve menteşe alanlarının geometrisini değiştirerek herhangi bir tek zincirli değişken parça için tasarlanabilen çeşitli yapı kombinasyonları vardır.
Bu protokolü, Jurkat hücrelerini kullanarak hedef hücreleri ortadan kaldırmada en iyi etkinliğe sahip kombinasyonları belirlemek için tasarladık. Bu, daha sonra geleneksel T hücreleri ile doğrulanan Jurkat hücrelerini kullanarak hedef hücre sitotoksisitesine dayalı olarak CAR yapılarını taramak için hızlı, yüksek verimli bir protokoldür. Bu teknik kullanılarak bir düzine farklı CAR yapısı aynı anda 96 oyuklu bir plakada test edilebilir.
Burada Akhavan Laboratuvarı'nda, birden fazla CAR yapısını taramak için yüksek verimli bir şekilde Jurkat hücrelerini eksprese eden CAR tarafından hedef hücrelerin doğrudan siklozunu mutlak sayılarla ölçüyoruz. Laboratuvarımızın birincil amacı, yüksek dereceli beyin tümörlerine karşı CAR T-hücre tedavisinin klinik çevirisini iyileştirmektir. CAR T hücresi sitotoksisitesini iyileştirmenin yanı sıra tümör mikro çevresini hedeflemek için bir yöntem olarak yüksek verimli ilaç ekranlarından yararlanıyoruz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin tümör hücrelerine karşı sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek kapasiteli bir yöntemi özetlemektedir. Bu yöntem, belirli tümör antijenlerini hedeflemek için en etkili kombinasyonları belirlemek amacıyla çeşitli CAR konstrüktlarının hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Kanser Biyolojisi
- Hücresel Terapi
Arka Plan
- Klinik sonuçların iyileştirilmesi amacıyla CAR T hücreleri geliştirilmektedir.
- CAR konstrüktlerinin optimize edilmesi için yüksek kapasiteli tarama yöntemleri gereklidir.
- Jurkat hücreleri, CAR etkinliğinin değerlendirilmesinde bir model olarak kullanılır.
- Bu çalışma, CAR konstrüktlerinin hedef hücrelere karşı sitotoksisitesine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- CAR konstrüktlarının verimli bir şekilde taranması için bir protokol geliştirmek.
- CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sitotoksik etkilerini nicelleştirmek.
- Tümör antijenlerini hedeflemek için optimal CAR konfigürasyonlarını belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek kapasiteli tarama için floresan görüntüleme.
- 96 kuyucuklu plaka formatında çok sayıda CAR konstrüktünün değerlendirilmesi.
- CAR eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından hedef hücre öldürülmesinin nicelendirilmesi.
- Doğrulama için geleneksel T hücresi yanıtları ile karşılaştırma.
Ana Sonuçlar
- Tümör hücresi öldürme için etkili CAR konstrüktlarının belirlenmesi.
- Jurkat hücreleri kullanılarak yüksek kapasiteli tarama yeteneklerinin gösterilmesi.
- Farklı konstrüktlar genelinde sitotoksisitenin kantitatif değerlendirmesi.
- Klinik uygulama öncesinde CAR tasarımlarının hızlı optimizasyon potansiyeli.
Sonuçlar
- Protokol, CAR konstrüktlarının verimli bir şekilde taranmasına olanak tanır.
- Jurkat hücreleri, CAR etkinliğinin değerlendirilmesi için güvenilir bir model sağlar.
- Bu yaklaşım, CAR T hücre tedavilerinin geliştirilmesini hızlandırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Jurkat hücrelerinde CAR konstrüktlarının hızlı ve yüksek kapasiteli sitotoksisite değerlendirmesi, kaynak yoğun birincil T hücresi validasyonu öncesinde, CAR tasarımlarının erken aşamada riskten arındırılmasını ve önceliklendirilmesini sağlar. Bu platform, üstün hedef hücre öldürme kapasitesine sahip menteşe-optimize CAR'ların tanımlanmasını hızlandırarak onkoloji hücre tedavisi portföy süreçlerinde verimli bir elemeyi destekler. Birden fazla konstrüktün sitotoksisitesini eş zamanlı olarak nicelleştirerek, ekipler kritik keşif karar noktalarında veri odaklı kararlar verebilirler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fonksiyonel hedef doğrulaması için CAR konstrükt permütasyonlarının hızlı bir şekilde sorgulanmasına olanak tanır.
- Kontrollü bir sistemde doğrudan sitotoksisiteyi nicelleştirerek mekanistik risklerin azaltılmasını destekler.
- Birincil T hücresi mühendisliği öncesinde, konstrükt seçimine yönelik öngörülebilir güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt akışlı yüksek kapasiteli tarama iş akışları için valide edilmiş CAR-Jurkat sistemleri hazırlar.
- Kantitatif floresan görüntüleme çıktıları ile sitotoksisite analizlerini standartlaştırır.
- Birden fazla CAR konstrüktünün paralel olarak tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir değerlendirmesine olanak tanır.
- 96 kuyucuklu plaka formatlarında güvenilir bileşik veya konstrükt değerlendirmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- PBMC kaynaklı T hücrelerinde bulguları doğrulayarak, erken sitotoksisite verilerini translasyonel hedeflerle ilişkilendirir.
- Keşif aşamasındaki konstrükt optimizasyonundan preklinik doğrulama adımlarına kadar süreklilik sağlar.
- Suboptimal CAR tasarımlarını erken aşamada eleyerek, geç aşama kaybı riskini azaltır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yüksek kapasitelile sitotoksisite platformu, erken keşif ve öncü bileşik belirleme aşamaları arasında yer alarak konstrükt tasarımını preklinik doğrulama ile birbirine bağlar. Kaynak yoğun primer T hücresi veya in vivo çalışmalara geçmeden önce hızlı hipotez testine ve konstrükt elemelerine olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: CAR etkinliği için menteşe ve hücre dışı alan modifikasyonlarının hipotez odaklı değerlendirmesini destekler.
- Tarama: Konstrukt karşılaştırması ve sıralaması için kantitatif, tekrarlanabilir sitotoksisite verileri sunar.
- Analitikler: Karar verme süreçlerini bilgilendirmek için mutlak hücre sayıları ve istatistiksel çıktılar (örneğin, tek yönlü ANOVA) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: PBMC kaynaklı T hücrelerinde konstrukt performansını doğrulayarak translasyonel sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Devam eden CAR konstrukt optimizasyon kampanyaları için ölçeklenebilir, yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: CAR konstrükt seçimine yönelik öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Sitotoksisite değerlendirmesini standardize eder ve ölçeklendirir, böylece kaynakların verimli kullanımını sağlar.
- Stratejik Değer: Konstrüktleri erken aşamada filtreleyerek "devam/dur" kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: CAR adaylarının riskle uyumlu önceliklendirmesini ve geliştirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- CAR konstrükt tasarımı ve Jurkat hücrelerinin lentiviral transdüksiyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Kantitatif okumalar için floresan görüntüleme cihazlarına ve analiz yazılımlarına erişim gereklidir.
- Deney düzeneği ve veri analiz parametrelerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer hücre modellerine veya antijenlere adaptasyon, protokol optimizasyonu gerektirebilir.
- Konstrükt karşılaştırması için güçlü istatistiksel analizlere (örneğin, ANOVA) bağımlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:42
Plating CFSE‐Labelled Tumor Cells and Co‐Culturing CAR‐Expressing Jurkats for In Vitro Cytotoxicity Evaluation
5:19
Preparation of Plate for Fluorescent Imaging and Cell Viability Assessment in CAR‐Jurkat Co‐Culture with CFSE‐Labeled Tumor Cells
![Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62334.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A24%253A38.282Z&w=384&q=75)
