Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Laboratuvarımız, solid ve kan kanserlerinin tedavilerini geliştirmek amacıyla doğal öldürücü hücrelerin potansiyelinden yararlanmayı hedefleyerek, bu hücrelerin sağlık ve hastalıktaki rolünü incelemektedir. Mevcut NK hücresi sitotoksisite analizleri, platformlar ve düzenekler arasında standartlaşmadan yoksundur. Bu protokol, doğru sitotoksisite değerlendirmesi için tekrarlanabilir canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi yöntemleri sunmaktadır.

Başlamak için, SYTOX Orange stok çözeltisini 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpünde NK-92 kültür medyası ile seyrelterek 10 mililitre 2x SYTOX Orange hazırlayın. Trypan Blue ile karıştırdıktan sonra bir Luna Sayıcı kullanarak hedef hücreleri sayın veya onaylanmış herhangi bir boya dışlama tabanlı hücre sayım yöntemini kullanın. Gerekli miktardaki hedef hücreyi 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Ardından, hedef hücreleri 2X SYTOX Orange ortamında mililitre başına 250.000 hücre olacak nihai konsantrasyona yeniden süspande edin. Efektör hücreyi hazırlamak için NK-92 hücre canlılığını ve konsantrasyonunu değerlendirin ve yalnızca canlılık %80'den yüksekse işleme devam edin; çünkü daha düşük canlılık assay performansını etkileyebilir.

Gerekli sayıda NK-92 hücresini sayın ve her biri 15 mililitrelik konik tabanlı santrifüj tüplerine aktarın. Santrifüjasyon sonrası hücreleri mililitre başına 500.000 hücre nihai konsantrasyona gelecek şekilde yeniden süspande edin. İkiye bir efektör-hedef oranlı hücreler için 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyucuklarına 240 mikrolitre efektör hücre ekleyerek efektör hücre dilüsyonlarını hazırlayın ve kalan kuyucuklara 120 mikrolitre medya ekleyin.

İkiye bir, bire bir ve 0,25'e bir efektör-hedef oranlarında iki katlı seri dilüsyonlar gerçekleştirin; pipetleme ile en az beş kez iyice karıştırın ve her transfer arasında uçları değiştirin. Ardından, ko-kültürü kurmak için polilizin kaplı, düz tabanlı 96 kuyucuklu plakayı hazırlayın. Transferden hemen önce, hedef ve efektör hücreleri kabarcık oluşturmadan iyice yeniden süspanse edin, ardından her bir hücre süspansiyonundan 100 µL'yi ilgili kuyucuklara ekleyin.

Ardından, çevredeki kullanılmayan kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 100G'de santrifüj edin. Plakayı canlı hücre görüntüleme sistemine yerleştirin.

37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında 24 saat boyunca her bir saatte bir görüntüler elde edin. İlk taramanın ardından görüntü kalitesini doğrulayın ve gerekirse görüntüleme ayarlarını düzenleyin. SYTOX Orange'ın yeşil kanala taşmasını düzeltmek için spektral ayrıştırmayı ayarlayın.

Turuncu pozitif ölü hücrelerin, yeşil pozitif hücreler olarak yanlış tanımlanmadığını doğrulayın. Adherent olmayan hücrelerin hücre bazında analizini yapılandırmak için, beklenen nesne çapını yaklaşık hücre çapıyla uyumlu olacak şekilde 15 micrometers olarak ayarlayın. Hücre kümelerinin ayrılmasını kolaylaştırmak için eşik hassasiyetini ve doku hassasiyetini beş, kenar hassasiyetini ise 10 olarak ayarlayın.

Döküntüleri ve büyük nesneleri hariç tutmak için kabul edilen nesne alanı filtre aralığını 50 ila 2.000 square micrometers olarak ayarlayın. Hücresel olmayan nesneleri hariç tutmak için maksimum eksantrisiteyi 0,95 olarak ayarlayın. 16 ila 24 saat boyunca kültüre edilmiş primer insan NK hücreleri temin edin.

500.000 hedef hücreyi 15 mililitrelik konik tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı uzaklaştırın. Beş milimolar CFSE stok çözeltisinin bir mikrolitresini 10 mililitre PBS içinde seyrelterek, PBS içinde 0.5 mikromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester veya CFSC çalışma çözeltisi hazırlayın. Elde edilen pellet'i, CFSE çözeltisi içerisinde mililitre başına yaklaşık bir milyon hücre olacak şekilde yeniden süspansiyona getirin.

Hücreleri, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılı halde 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Ardından, beş ila 10 hacim kültür ortamı ekleyerek reaksiyonu durdurun ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüj ettikten sonra, 100 µL'nin 25.000 hücre içerecek şekilde, hücre peletini mililitrede 250.000 hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın belirlenen kuyucuklarına kuyucuk başına 100 µL hedef hücre ekleyin. Her koşulu üç tekrar şeklinde platlayın. Ardından, her test antikoru ve eşleşen izotip kontrolü için NK hücresi kültür ortamında 200 µL 4X antikor çözeltisi hazırlayın.

Antikor çözeltilerini derin kuyucuklu bir plakaya aktarın. Hedef hücreleri içeren her bir kuyucuğa 50 microliter antikor çözeltisi ekleyin ve pipetle en az beş kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Antikor içermeyen kontrol kuyucuklarının her birine 50 microliter NK hücresi kültür medyumu ekleyin ve pipetleme yoluyla iyice karıştırın.

Plakayı standart inkübasyon koşulları altında 25 ila 30 dakika inkübe edin. 200.000 NK hücresini sayıp elde edin ve yalnızca canlılık %75'e eşit veya daha büyükse işleme devam edin. Hücreleri, 800 µL birincil insan NK hücresi kültüründe mililitre başına 250.000 hücre olacak şekilde yeniden süspande edin. İlgili kuyucuklara kuyucuk başına 50 µL NK hücresi ekleyin ve pipetle en az beş kez yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın.

Ardından, kontrol kuyucuklarının her birine 50 µL kültür ortamı pipetleyin ve iyice karıştırın. Tüm kuyucukların 200 µL içerdiğini, menisküs seviyelerinin tekdüze olduğunu ve hava kabarcığı bulunmadığını onaylamak için yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakayı dikkatlice inceleyin. Plakayı 100G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin, ardından standart inkübasyon koşulları altında 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin.

Plakayı 300G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Tüm kuyucukları, kuyucuk başına 200 µL floresan aktive hücre ayıklama veya FACS tamponu ile yıkayın. Burada sunulduğu şekilde, FACS tamponu içerisinde bir yüzey antikoru ana karışımı hazırlayın.

Hücreleri, kuyuk başına 50 µL antikor master karışımı içerisinde tekrar süspanse edin ve pipetle en az beş kez aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın. Plakayı, ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılı halde, 4 °C'de 15 dakika inkübe edin. Kuyuk başına 150 µL FACS tamponu ekleyin.

Santrifüj işleminin ardından, hücreleri kuyuk başına 100 µL FACS tamponu içinde beş µM DAPI ile yeniden süspande edin. Ön inkübasyon yapmadan hemen akış sitometrisi veri toplama aşamasına geçin. Akış sitometrisini Cytek Aurora cihazını kullanarak gerçekleştirin ve CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI ile varsa diğer floroforlar için floresans kanallarını kaydedin.

Ko-kültür sırasında efektör hücreler, canlı hedef hücreler ve ölü hücreler gerçek zamanlı canlı hücre mikroskopisi kullanılarak görselleştirildi. Eşit efektör/hedef oranında, özellikle erken zaman noktalarında, CAR2 ve CAR3 NK-92 hücreleri, CAR1-NK-92 hücrelerine kıyasla daha hızlı öldürme kinetiği sergiledi. Doğal sitotoksisite gösteren kontrol NK-92 hücreleri de dahil olmak üzere, hedef hücre öldürme oranı daha yüksek efektör/hedef oranlarıyla birlikte arttı.

CAR2 ve CAR3 NK-92 hücreleri, daha geç zaman noktalarında daha düşük efektör/hedef oranlarında daha yüksek potansiyel göstermiştir. Önceki zaman noktalarında ise orta düzey efektör/hedef oranlarında artmış potansiyel gözlemlenmiştir. CAR-NK-92 hücresi potansiyelini, öldürme kinetiğini ve efektör popülasyonları genelindeki toplam sitotoksik performansı nicelleştirmek için KR50, KT50 ve IKI-50 şeklinde üç parametre tanımlanmıştır.

Yalnızca daratumumab eklenmesi hedef hücre sağkalımını azaltmamıştır; bu da efektör hücrelerin yokluğunda antikorun hedef hücre canlılığı üzerinde doğrudan bir etkisinin olmadığını doğrulamıştır. Yalnızca NK hücreleri ile birlikte kültürleme, hedef hücre sağkalımını yaklaşık %70'e düşürerek temel doğal sitotoksisiteyi göstermiştir. Daratumumab eklenmesi, hücre sağkalımını yaklaşık %37'ye kadar daha da düşürmüştür; bu durum artan antikor aracılı sitotoksisite ile tutarlıdır.

Buna karşılık, izotip kontrol koşulu, NK tek başına koşulu ile benzer şekilde yaklaşık %62 sağkalım göstermiştir. NK hücresi degranülasyonu, antikor içermeyen NK hücresi hedef hücre ko-kültüründe en düşük seviyede gerçekleşirken, daratumumab ile tedavi edilen koşulda yaklaşık %31 ile en yüksek seviyeye ulaşmıştır; izotip kontrolü ise yaklaşık %19 ile orta düzeyde bir degranülasyon göstermiştir. Bu protokol, araştırmacıların NK hücresi doğal sitotoksisitesini nicelleştirmesine, CAR-NK tasarımlarının tümör öldürme kapasitesini değerlendirmesine ve monoklonal antikorların ADCC etkinliğini karşılaştırmasına olanak tanır. Bu protokolü uygularken dikkat edilmesi gereken temel husus, güvenilir ve yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için NK ve hedef hücrelerin doğru ve tutarlı şekilde sayılması, pipetlenmesi ve plaklara eklenmesinin sağlanmasıdır.

Gelecekteki çalışmalar, NK hücresi immün kaçışını araştırmak, tümör duyarlılığını karşılaştırmak ve farklı kanser türlerinde yeni NK hücresi tabanlı immünoterapileri değerlendirmek için bu protokollerden yararlanabilir.