Tek kullanımlık Diagnostics mikroakışkan Uygulamaları

Benim adım Catherine CloudBridge; Boston Üniversitesi'nde imalat, mühendislik ve biyomedikal mühendisliği profesörüyüm. Aynı zamanda Biyomedikal Mikro Cihazlar ve Mikroortamlar Laboratuvarı'nın direktörüyüm. Temel olarak, kaynakların sınırlı olduğu ortamlardaki uygulamalar için tek kullanımlık tanı kitleri üretimi üzerine çalışıyoruz.

Bu cihazları üretmek için mikroakışkanlar kullanıyoruz. Aslında iki çalışma alanı ile ilgileniyoruz. Temel olarak, biyomoleküllerin ve hücrelerin plastik polimer yüzeylerle nasıl etkileşime girdiğini incelemekle ilgileniyoruz.

Bu, ana çalışma alanımızdır. Bu çalışma, tek kullanımlık tanı kitleri için mikroakışkan uygulamalarında somutlaşmaktadır. Dolayısıyla laboratuvarda mikroakışkan cihazlar üretiyoruz.

Termoplastik malzemelerde tipik olarak laboratuvarda mikroakışkanlar üretmek için çoğu kişinin kullandığı kauçuksu bir malzeme olan PDMS'yi kullanmayız. Cihazlarımızı termoplastiklerden üretiriz. Bu termoplastik cihazları, moleküler biyolojinin merkezi bir laboratuvardan uzakta, sahada gerçekleştirilebileceği şekilde mikro ölçekte moleküler biyoloji çalışmaları yapmak için kullanmakla ilgileniyoruz.

Bunun laboratuvardaki uygulaması şu şekildedir: Küçük plastik kartlar hazırlıyoruz ve bu küçük plastik kartların içinde katı faz ekstraksiyon kolonları, hücre liziz kolonları veya karıştırma kolonları yer alıyor. Ayrıca bir tespit tekniği olarak çip üzerinde polimeraz zincir reaksiyonu da gerçekleştiriyoruz. Tüm bunlar küçük bir cihaza entegre edilmiştir; araştırmanın uzun vadeli perspektifinde bu, el yapımı ve sahaya veya santrifüjler, ısıtmalı inkübatörler ve benzeri donanımlara sahip büyük ölçekli bir laboratuvarın bulunmadığı ortamlara taşınabilecek entegre bir cihaz haline gelecektir.

İdeal olarak, örneğin kan, idrar, dışkı veya mukus içeren bir nazofaringeal sürüntü gibi bir insan örneğiyle başlamak ve ardından çipin çıkışında, kişinin belirli bir mikroorganizmaya enfekte olup olmadığına dair evet veya hayır şeklinde bir yanıt almak istiyoruz. Bunu, mikroorganizmanın türüne bağlı olarak, hastanın örneğindeki o belirli mikroorganizmanın DNA'sını veya RNA'sını arayarak gerçekleştiriyoruz.

Bu nedenle, ortaya çıkan teknik zorluklar büyük ölçüde denklemin numune hazırlama tarafındadır. Kan, dışkı veya idrarla başladığınızda; içinde çok sayıda potansiyel partikül veya PCR ile diğer amplifikasyon teknikleri için inhibitörler bulunan karmaşık bir insan numunesi durumundan kurtulmanız gerekir. Ve sonuçta, aradığınız bir mikroorganizmanın orada olup olmadığını size söyleyecek belirli bir DNA veya RNA'yı amplifiye etmek veya aramak için kullanabileceğiniz, çok temiz bir elüe nükleik asit numunesi elde etmek istersiniz.

Bu nedenle, bu örnekleri temizlemek için birkaç işlem yapmanız gerekir. İlk olarak, örneği filtrelemeniz gerekir; bu işlem, örneğin türüne bağlı olarak, örnek çipe yerleştirilmeden önce kaba filtrasyon veya hızlı bir santrifüj aşamasını içerebilir. Bu yüzden, her zaman klinikçiden geldiği haliyle örneklerle başlamaya çalışıyoruz.

İdrar, dışkı ve nazofaringeal sürüntü örneklerinde amacımız, klinisyenin işini normalde yaptığı gibi yapması ve örneği her zamanki şekilde almasıdır. Ardından bu örneği alıp çiplere yerleştiriyoruz. Dolayısıyla, bu aşamada daha fazla filtrasyon gerekirse, bu filtrasyon işlemine çip içerisinde yer verilecektir.

İkinci adım, moleküler analizler yaptığımız için numunedeki hücrelerin ve mikroorganizmaların liz edilmesi sürecini içerir. Bu nedenle, genellikle numunenin küçük gözenek boyutuna sahip bir filtreden geçirilmesini içeren bir liz adımı gerçekleştiririz. Bazen bu filtre, üzerinde karbon nanotüpler gibi keskin kenarlı nanopartiküller barındırır; bunlar, çalıştığımız ve liz edilmesi oldukça zor olan gram-pozitif bir bakteri olan C difficile gibi daha dayanıklı hücre duvarlarına sahip bazı organizmaları parçalamak için kullanılabilir.

Bu nedenle daha dayanıklı lizis kolonlarına sahip olmamız gerekiyor. Ancak genellikle çip içerisinde kombine bir kimyasal ve mekanik lizis gerçekleştiriyoruz. Bundan sonraki hedefimiz, lizatı alıp ardından saflaştırılmış nükleik asitleri ekstrakte etmektir.

Ardından lizatı, mikroakışkan çip içinde yer alan bir katı faz ekstraksiyon kolonuna aktarıyoruz. Bu katı faz ekstraksiyon kolonu plastikten yapılmıştır ve mikroakışkan kanal fabrikasyon aşamasından sonra kanal içinde foto-başlatmalı kimya kullanılarak oluşturulmuştur. Ayrıca, nükleik asitleri bağlamak ve serbest bırakmak istediğimiz için genellikle silika partikülleri ile emdirilmiştir.

Bazı durumlarda, örneğin özellikle mRNA'yı bağlamak ve serbest bırakmak istiyorsak oligo DT boncuklarını veya belirli proteinleri bağlayıp serbest bırakmak istiyorsak üzerlerinde belirli antikorlar bulunan boncukları dahil ettik. Tüm bu işlemleri gerçekleştiren ekstraksiyon kolonları hazırlayabiliriz. Ancak bugün, silika boncuklar ile baz ekstraksiyon kolonunun nasıl yapılacağını göstereceğiz.

Bunu yaptıktan sonra, lizatı silika kolonundan geçirin; bu işlem, makro ölçekli bir laboratuvardaki Qiagen kitinin çalışma prensibiyle aynıdır. Ardından, hücre lizatında ve insan örneğinin geri kalanında bulunan, istemediğimiz tüm karbonhidratlar, lipidler ve diğer maddelerden kurtulmak için yıkama işlemini gerçekleştiriyoruz. Ve en sonunda, su ile elüsyon yapıyoruz.

Bu mikro ölçekli katı faz ekstraksiyon kolonlarının güzel yanı, genellikle 1 ila 5 µL civarında çok küçük bir miktarda su ile elüsyon yapabilmemizdir. Böylece eklediğimiz nükleik asitlerin neredeyse tamamını geri kazanıyoruz. O kanaldan geri aldığımız ilk 10 µL'de yaklaşık %70 ila %90 oranında bir verimlilik elde ediyoruz.

Böylece, iki ile 10 µL arası miktarlarla iki kez yıkama yaptığımızda, oraya koyduğumuz nükleik asitlerin neredeyse tamamını geri kazanırız. Dolayısıyla bu, sadece PCR'a uygun temiz bir örnek değil, aynı zamanda standart bir masaüstü kit ile elde edebileceğinizden çok daha yüksek konsantrasyonlu bir örnektir. Tüm bu örnek hazırlama tekniklerinin nihai amacı, diğer araştırmacıların yaptığı bazı çalışmalarla uyumlu sonuçlar elde etmektir.

Çip üzerinde PCR amplifikasyonu yapılabileceğini gösteren, alanda oldukça başarılı bir çalışma. Eğer bir RNA virüsü ile çalışıyorsanız veya bir gen ekspresyon deneyi yapmak istiyorsanız, ters transkriptaz reaksiyonunu da çip üzerinde gerçekleştirebilirsiniz. Örnek hazırlama tekniklerimiz, çip üzerindeki PCR ile doğrudan eşleştirilebilir; böylece tüm temizleme ve örnek hazırlama işlemlerini laboratuvar tezgahında yapmanıza gerek kalmaz.

Ve ayrıca, küçük bir çip üzerinde multipleks PCR gerçekleştirmek için gerekli olan çok küçük hacimlere ulaşmak amacıyla yapmanız gereken konsantrasyon basamağını da ele alacağız. Bu nedenle, bugün size göstereceğimiz deneyler, PDMS yerine termoplastikten üretilmiş mikroakışkan çipin nasıl monte edildiğini, tipik olarak kullanılan yöntemden biraz daha farklı olan üretim sürecini ve bu çiplerin nasıl mühürlendiğini göstermektedir.

Ardından, hem hücre lizisi hem de katı faz ekstraksiyonu için kullanılan polimer monolitleri oluşturmak amacıyla çip içerisinde ışıkla başlatılan kimyasal işlemleri nasıl gerçekleştirdiğimizi göreceğiz. Şu an laboratuvarda modüler süreçler olan ancak entegre edilebilen ve edilmiş olan bu sürecin sonunda, bir PCR modülüne veya mikroorganizma ya da enfeksiyon teşhisinin yapılabileceği başka bir amplifikasyon modülüne aktarılabilecek, su içerisinde yüksek konsantrasyonlu nükleik asit, RNA ve DNA örneği elde etmiş olursunuz. Şu anda üzerinde çalıştığımız bir hibe projemiz kapsamında, Boston Tıp Merkezi'nden Influenza A enfeksiyonu olan veya olmayan hastalardan insan örnekleri toplamaya başladık. Şu an grip sezonu olduğu için topladığımız örnekler bunlardır.

Ardından laboratuvarda, bir kişinin Influenza A ile enfekte olup olmadığını belirlemek için temel olarak birkaç gün süren bir kültür testi olan altın standart analizleri gerçekleştiriyoruz. Buna paralel olarak, bu örnekleri şu anki çip modüllerimizden geçiriyoruz. Örnekleri önce lizis kolonundan, ardından katı faz ekstraksiyon kolonundan geçiriyoruz ve altın standart yöntemlerle kıyaslandığında ne kadar başarılı olduğumuzu görmek için PCR uyguluyoruz.

Şu an bulunduğumuz aşama bu. Eğer bu deneyler başarıyla sonuçlanırsa, önümüzdeki dört ila altı yıl içinde influenza A için entegre bir çipe ve eksiksiz bir analize sahip olduğumuz bir duruma gelebileceğimizi düşünüyorum; ayrıca clostridium difficile ve dışkı örnekleri üzerinde de çalışıyoruz. Ve sadece cihazın değil, aynı zamanda analiz yönteminin de entegre edilmesine çok yakınız.

Dolayısıyla hem analiz geliştirme hem de çip tasarımı el ele yürütülmelidir. Belirli bir uygulama için, yani hasta başı kullanım aşamasına geçmek için bu süreç gerçekten hedef odaklı bir süreçtir. Çipi hasta başı kullanımına uygun şekilde optimize edebilmek için başlangıç örneğinizi ve aradığınız mikroorganizmayı bilmeniz gerekir.

Bu yüzden, bunu bir prototip şeklinde gerçekleştirme aşamasına çok uzak olmadığımızı düşünüyorum. Nihai hedeflerimiz bunlar, bu yüzden oraya ulaşacağımızı umuyorum.