Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Doku kaynaklı eksozomlar, doku özgüllüğünü ve mikro çevreyi doğru bir şekilde yansıtma yetenekleri nedeniyle artan ilgi görmüştür. Araştırmamız, kardiyovasküler hastalıklarda dalak kaynaklı eksozomların temel ve translasyonel rollerini anlamaya odaklandı. Bu çalışmada, farelerin dalak dokularından eksozomları izole etmek için pratik bir protokol geliştiriyoruz ve daha sonraki tanımlama analizi ve fonksiyonel çalışmalar için tekrarlanabilir bir teknik sağlıyoruz.

Sindirim için bir Tip I kollajenaz kullanıyoruz, ardından yüksek kaliteli dalak eksozomu elde etmek için diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla filtrasyon yapıyoruz. Önceki raporların aksine, doku süspansiyonu elde etmek için doku homojenizasyonunu kullanarak, yaklaşımımız dokulardaki hücrelerin zar bütünlüğünü korur. Bu teknik, eksozomun bağışıklık tepkilerindeki rolünü incelemede özellikle yararlı olabilir.

Dalağın bağışıklık sistemindeki kritik işlevi göz önüne alındığında, gelecekteki çalışmalar bu protokolü insan dokularına uyarlayabilir ve tanı ve tedavi amaçlı klinik olarak ilgili eksozomun çıkarılmasını sağlayabilir. Başlamak için, yüksek hızlı ve ultra yüksek hızlı santrifüjleri dört santigrat dereceye önceden soğutun ve masaüstü çalkalayıcının sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. 100 milimetre çapında hücre kültürü kaplarını hazırlayın.

Ardından, 50 mililitre steril santrifüj tüpleri, buz ve 70 mikrometre çapında steril hücre süzgeçleri düzenleyin. Makası ve forsepsleri sterilize etmek için %75 alkol püskürtün ve daha fazla sterilize etmek için yüksek sıcaklıkta ısıtın. Daha sonra dalak dokusunu buz üzerinde steril 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve yüzeydeki kanı soğuk 1X PBS ile yıkayın.

Dokuları tartmadan önce dalağı steril gazlı bezle iyice kurulayın. Daha sonra, steril bir transfer pipeti kullanarak, nemlendirmek için 70 mikrometrelik bir hücre süzgecine bir mililitre PBS ekleyin. Son olarak, sindirim tamponunu elde etmek için bir girdap karıştırıcı ile 1X PBS'de% 0.1 Tip I kollajenaz hazırlayın.

Başlamak için, doku işleme için reaktifleri ve steril araçları hazırlayın. Makasla, dalak dokusunu buz üzerinde bir kültür kabında küçük, düzgün parçalar halinde kesin ve steril bir transfer pipeti kullanarak 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, dalak dokusunun ağırlığına bağlı olarak sindirim tamponunu tüpe ekleyin ve tüpü 37 santigrat dereceye ayarlanmış yatay bir çalkalayıcı üzerinde 45 derecelik bir açıyla sallayın.

Doku parçaları dağıldığında ve parçaların çoğu şeklini kaybettiğinde sindirimi durdurun. Fibröz ve daha büyük doku kalıntılarını gidermek için sindirilmiş karışımı oda sıcaklığında 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Süzüntüyü 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpünde toplayın.

Süzüntüyü 500 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve santrifüjleme adımını uygun hızlarda tekrarlayın. Ultrasantrifüjlemeden sonra, süpernatanı atın ve peleti PBS ile yıkayın.

Eksozomları izole etmek için dört santigrat derecede iki saat boyunca 120.000 G'de tekrar ultrasantrifüj edin. Son olarak, izole edilen eksozomları dalak başına 200 mikrolitre steril PBS'de çözün ve eksi 80 santigrat derecede iki mililitrelik bir santrifüj tüpünde saklayın. Transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri, eksozomların karakteristiği olan bir lipid çift tabakasına sahip fincan şeklindeki veziküllerin varlığını ortaya çıkardı.

Eksozom boyutları, boyut dağılım grafiğinde gösterildiği gibi 60 nanometrede tepe konsantrasyonu ile 30 ila 150 nanometre arasında değişmektedir. Western blot analizi, ekzozomal belirteçler TSG101 ve CD9'un varlığını doğrularken, GM130 ve negatif kontrol tespit edilmedi.