Mısır Meiositlerinde Üç Boyutlu İmmünolokalizasyon

Araştırmamız, mısır erkek meyositlerini incelemek ve tek hücrelerdeki meyotik proteinleri görselleştirmek için 3B bir yaklaşım geliştirmeye odaklanmaktadır. Bu protokol, mısıra ek olarak pirinç, çavdar, arpa ve buğdaydaki meyositlerin incelenmesinde de uygulanabilir. Başlamak için, çiçeketleri hala gövdenin içinde büyümekte olan V13 evresindeki mısır bitkilerini temin edin.

Miyotik anter fiksasyonunun yapıldığı hafta, eldiven giyilmiş haldeyken, genişlemiş gövdenin şişkin kısmına nazikçe bastırarak kesilip açılacak kadar yumuşak olup olmadığını kontrol edin. Gerekli tampon çözeltileri hazırladıktan sonra, plastik bir kutunun içine beş ila 10 adet nemlendirilmiş kağıt havlu yerleştirerek nemli bir hazne hazırlayın. Haznedeki fazla suyu uzaklaştırın.

Bir jilet kullanarak, püskül dallarını ve yan dalları açığa çıkarmak için gövdeyi çiçeklenme seviyesinden kesin. Yan dalları diseke edip topladıktan sonra, oda sıcaklığında tutulan nemli hazne havlularına sarın. Bir stereo mikroskop kullanarak, çiçekçiklerden taze anterleri, iki mililitre 1X tampon A veya BA içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına toplayın. Boyut ve renge göre miyotik evreleri belirleyin.

Anterler yeni bir 35 milimetrelik Petri kabına aktarıldıktan sonra, anterlere üç mililitre tespit çözeltisi ekleyin. Formaldehit buharlaşmasını önlemek için Petri kabını parafilm ile mühürleyin. 35 milimetrelik Petri kabını, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 40 ila 60 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcı üzerindeki daha büyük Petri kabının üzerine yerleştirin.

Anterleri üç mililitre 1X BA ile durulayın. Anterleri küçük bir Petri kabına aktardıktan sonra, Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında, hızı 40 ile 60 RPM arasında ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıda 45 dakika boyunca bekletin. Temiz bir pens kullanarak anterleri, içinde üç mililitre 1X BA bulunan küçük 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Petri kabı parafilm ile sıkıca kapatıldıktan sonra, küçük Petri kabını daha büyük bir Petri kabının içine yerleştirin. Alüminyum folyo ile kapladıktan sonra, örneği kullanıma kadar dört degrees Celsius'ta saklayın. Birinci günde, eşit hacimlerde acrylamide ve two XBA karıştırarak iki milliliters acrylamide çözeltisi hazırlayın.

Sodyum sülfit ve amonyum persülfat eklemeden önce akrilamid çözeltisini vakum altında beş ila 10 dakika boyunca gazdan arındırın. Hazırlanan lam sayısına göre, bir bir akrilamid ve iki XBA karışımından 100 µL'lik alikotları 1,5 mL'lik tüplere paylaştırın. Bir Petri kabının üzerine iki santimetreye iki santimetrelik parafilm parçaları yerleştirin ve bunları bir diseksiyon stereoskobunun altına konumlandırın.

Pipet ucu makasla kırpıldıktan sonra, anter içeren 50 µL BA çözeltisini parafilmin üzerine pipetleyin. Parafilmin başka bir alanına 25 µL BA çözeltisi pipetleyin. Anterleri pensle tuttuktan sonra, bir skalpel kullanarak uçlarını kesin.

Meiyositler dışarı itildikten sonra, onları bir pipet yardımıyla 25 µL BA damlasına aktarın ve nazikçe karıştırın. Meiyosit karışımından 10 µL'yi ayrı bir lamel üzerine pipetleyin. Akrilamid ve iki XBA içeren 1,5 mL'lik bir tüpe hızla beş µL sodyum sülfit ve beş µL amonyum persülfat ekleyin.

Bu karışımdan beş µL'yi lamel üzerine pipetleyin ve meyositlerle karıştırın. Üzerine poli-lizin kaplı bir lameli 45 derecelik açıyla yerleştirin. Oda sıcaklığında tam polimerizasyon için 30 ila 50 dakika bekledikten sonra, lamelleri bir jilet yardımıyla dikkatlice ayırın.

Ardından, bunları bir Petri kabına ped tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Lamelini, oda sıcaklığında iki saat boyunca bir milimolar etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve %1 Triton ile desteklenmiş bir mililitre 1XPBS ile durulayın. Tespit sırasında belirgin sinyaller elde etmek için farklı konak türlerden gelen primer antikorları hazırlayın ve birleştirin.

Seyreltilmiş birincil antikordan 50 µL'yi, pedi içeren lamelin merkezine ekleyin. Ardından, Petri kabını gece boyunca nemli bir bölmeye yerleştirin. İkinci günde; 1X PBS, %0,1 Tween 20 ve 1 mM EDTA içeren 500 mL yıkama tamponu hazırlayın.

Bir pipet kullanarak, gece boyu bekletilen çözeltiyi uzaklaştırın. Lamelini bir mililitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Tamponu uzaklaştırdıktan sonra, tekrar bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bu yıkama adımını yedi kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kabın ağzını kapatın ve bir nemli oda içerisinde gece boyunca bekletin. Sekonder antikorları, bloklama tamponunda 1/50 oranında seyrelterek hazırlayın.

Yıkama solüsyonu uzaklaştırıldıktan sonra, her bir pad'in merkezine 50 µL seyreltilmiş sekonder antikor ekleyin. Ardından, Petri kabını oda sıcaklığında iki saat boyunca nemli bir hazneye yerleştirin. Solüsyon kuyucuktan uzaklaştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında her biri bir saat sürecek şekilde, bir mililitre yıkama tamponu ile dört kez yıkayın.

Kuyucuğu 1 mL PBS ile 10 dakika boyunca yıkayın ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Kuyucuğa, son konsantrasyonu 1 µg/mL olacak şekilde hazırlanan 500 µL DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Uzatılmış altını 4 °C'den çıkardıktan sonra, oda sıcaklığına ulaşana kadar çözdürün.

Lamları bir mililitre PBS ile 30 dakika boyunca yıkayın ve bu işlemi iki kez tekrarlayın. Son yıkama çözeltisini uzaklaştırdıktan sonra, pedi merkezine iki damla prolonged antifade ekleyin. Lamel kuyucuktan kaldırıldığında, etiketlenmiş lamların üzerine monte edin.

Bir vakum kullanarak lamel kenarlarındaki fazla gliserolü temizleyin ve iki kat oje ile mühürleyin. Görüntüleri yakalamak için uygun eksitasyon dalga boyları ve filtreleri kullanarak lamları mikroskop altında inceleyin. DAPI boyaması; net bir çekirdek ve kromatin boyamasının yanı sıra, plastid ve mitokondriyal DNA'nın daha sönük doğal sitoplazmik boyamasını göstermiştir.

Preleptinema sırasında kromozomlarda ve sitoplazmada lokalize olan Absence of first division one veya AFD1, asynaptic one veya ASY1 ve Zipper1 veya ZYP1 görülmüştür. Daha sonraki aşamalarda, sinapsis tamamlanmadan önce sinyal kromozom üzerinde yoğunlaşırken, önemli miktarda ZYP1 sitoplazmada kalmaya devam etmiştir. Meyotik kohezin AFD1, ancak zigonema sonrasında lineer bir yapı oluşturmuştur.

Sinaptonemal kompleksin lineer filamentlerinin oluşumuyla eş zamanlı olarak, ZYP1 ve AFD1 lineer yapılara yüklendikten sonra ASY1 sinyali nispeten zayıflamıştır. Bu protokol, araştırmacıların protein ko-lokalizasyonunu ve dinamiklerini, doğal subselüler lokalizasyonu, 3B kromozomal mimariyi, meyotik ilerlemeyi ve evrelemeyi incelemelerine olanak tanır.

Bu protokoldeki temel zorluk, primer ve sekonder antikorların uyumlu kombinasyonlarının dikkatle seçilmesidir. Çalışmalar, athelchasminin altında yatan moleküler mekanizmayı araştırmak için erkek ve dişi mayozunu karşılaştırarak bu çalışmanın üzerine inşa edilebilir.