Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, laboratuvar hayvanlarında dış kaynaklı enfeksiyöz ajanlara karşı antikorları tespit etmektir. Bu işlem, test serumunun antijen kaplı mikrokürelerle inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından serum, herhangi bir antijen-antikor immün kompleksini tespit eden, biyotinline etiketli türe özgü bir anti immünoglobulin ile inkübe edilir.

Ardından, multipleks floresans, immünassay net skoru ve floresan örnek değerlerine dayanarak laboratuvar kemirgenlerindeki yaygın ajanlar için pozitif veya negatif antikor durumunu gösteren biotinillenmiş immünoglobulin sonuçlarını saptamak amacıyla streptavidin işaretli FICO eryn Fluor force solüsyonu eklenir. Bu tekniği ELISA gibi mevcut yöntemlere göre kullanmanın temel avantajı, MFIA'nın bir multipleks assay olmasıdır. Bu durum, bir araştırmacının tek bir testte yüz farklı assay'e kadar tarama yapmasına olanak tanır.

Bu teknik, mevcut yöntemlerde kullanılan serum bölgelerinin ve tek kullanımlık malzemelerin miktarını azaltırken, tek bir testten elde edilen bilgi miktarını artırmaktadır. Çok sayıda serum örneğini birden fazla ajan için test ederken iş gücünü ve test süresini azaltmak istememizle birlikte, bu yöntemi kullanma fikri ilk kez ortaya çıktı. Prosedürü, laboratuvarımızın kıdemli teknoloğu Donna Cohen uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, multipleks floresan immünassay veya MFIA prosedürü için gerekli olan iki tampon çözeltiyi hazır bulundurun.

İlki, Charles River'dan temin edilebilen ve assay yıkama tamponu için spesifik olmayan etkileşimleri azaltmak amacıyla tescilli bloklama ajanları içeren bir birincil dilüenttir. Partikülleri uzaklaştırmak için pH 7.4'te %1BSA içeren bir PBS çözeltisi hazırlayın. Tamponu, assay yıkama tamponu kullanarak 0.2 mikronluk bir şişe üstü filtre ünitesi aracılığıyla steril etiketli kaplara filtreleyin.

Test serum inkübasyon basamağı sırasında oluşan antijen antikor komplekslerini işaretlemek için kullanılacak biyotinile antitürler (IGG veya BAG) ile strep AVID ve FICO erything veya SPE'nin iki kat konsantrasyonlarını hazırlayın; şu malzeme ve sarf malzemelerini hazırlayın: çok ve tek kanallı mikropipetler ve uçlar ile protein dilüsyonu için 96 kuyucuklu düşük protein bağlama kapasiteli mikrotiter plakalar. Kan örneklerini toplayıp serumu izole ettikten sonra, örnekleri bir 96 kuyucuklu mikrotiter plakada birincil dilüent ile dilüye etmeden önce, kuyucukların uygun ve üniform şekilde boşaltılmasını sağlamak için serumu kısa süreliğine vorteksleyin. 96 kuyucuklu test plakasının her kuyucuğunu analiz yıkama tamponu ile önceden ıslatın ve analiz boyunca çözeltiyi yavaşça aspire edin.

Boncukların kümelenmesini ve filtre membranına sıkışmasını önlemek için aspirasyon işlemi beş ila 10 saniye sürmelidir; bu durumların her ikisi de analiz sonundaki okuma sürelerini yavaşlatabilir. Test plağının alt kısmını kağıt havluyla kurulayarak sıvı drenajının durduğunu doğrulayın. İnkübasyon sırasında kuyucuklardan sıvı çekilmesini önlemek için her yıkama adımından sonra test plağını kurulamak önemlidir.

Boncukları hazırlamak için öncelikle stok eşlenmiş boncuk süspansiyonunu vorteksleyin. Ardından, boncukları bir banyoda kısa süre sonikasyona tabi tutun. Daha uzun okuma sürelerine yol açabilen agregat boncuk kümelerini önlemek için boncukların düzgün bir şekilde yeniden süspanse edilmesi kritik önem taşımaktadır.

Ardından, 20 x stok süspansiyonu, primer dilüent içindeki iki x çalışma boncuk çözeltisine dağıtın. Daha sonra, iki x boncuk süspansiyonundan 50 µL'yi önceden ıslatılmış test plakasının her bir analiz kuyucuğuna aktarın. Önceden tanımlanmış plaka haritasına göre, her bir iki x test ve kontrol serumundan 50 µL'yi test plakasına pipetleyin.

Kapağı plakaya sabitleyin. Çözeltilerin buharlaşarak deneyin başarısını engellemesini önlemek için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında, orbital bir çalkalayıcıda 60 dakika inkübe edin. Tüm inkübasyon adımları boyunca test plakasını plaka kapağıyla kapalı tutun.

Ek olarak, boncukların süspansiyon halinde kalmasını ve serum antikorlarının kenetli antijenlerin tüm yüzeylerine erişebilmesini sağlamak için çalkalama hızı 400 RPM'den büyük, ancak 700 RPM'den küçük olmalıdır. Boncukların BAG ve SPE ile ardışık inkübasyonları sonucunda plakayı yıkadıktan sonra, numuneleri tekrar yıkayın. Ardından, plaka okumasını gerçekleştirmek için 125 µL analiz yıkama tamponu ekleyerek boncukları yeniden süspanse edin ve iki dakika boyunca çalkalayın.

Boncuklar süspanse edildikten sonra 10 dakika içinde analiz okuyucuya yerleştirin; boncuklar, iki lazere maruz kaldıkları bir detektörden teker teker geçerler. Bir lazer, boncukların renk setini tanımlayan dahili boyaları uyarır ve diğeri ise FICO erything raporlayıcı boyayı uyarır. Önceden belirlenmiş sayıda boncuk için FICO erything floresans yoğunluğu FM FI olarak bildirilir; seçilen boncuk panelinin test kuyucuklarındaki boncuk profiliyle eşleştiğini doğrulamak için ilk kuyucuğu okuyun.

Protokol ekranında, belirlenmiş boncuk bölgesinin dışına düşen boncuklar varsa, yanlış profil seçimi yapılmış demektir. Uygun şekilde yeniden süspande edilmiş boncuklar, analiz okuyucu yazılımında belirtildiği üzere kendi tanımlanmış bölgelerini dolduracaktır. Boncuklar agregasyona uğramışsa, bölgelerini yavaş bir hızda doldururlar.

Test plakasını okuyucudan çıkarabilir ve boncukları ayırmak için kuyucukları manuel olarak yeniden süspanse edebilirsiniz. Test plakasını okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğu üç ila dört kez pipetleyin. Ardından test plakasını okuyucuya geri yerleştirin ve sonuçları incelemeye devam edin.

Yetersiz boncuk sayımı veya düşen IgG anti IgG boncuk skorları gibi hataları raporlayın ve bu örnekler için analizi tekrarlayın. Verileri Excel'e aktarıp net MFI değerini hesapladıktan sonra, yüksek aralıklı immün serum hariç, herhangi bir test plağı analiz kontrolünün başarısız olup olmadığını belirleyin. Başarısız olan kontroller kabul edilemez ve analiz tekrarlanmalıdır.

Bu tablo, tipik bir analiz plağından alınan test serumu ve analiz kontrol verilerini temsil etmektedir. Tüm IgG kontrolleri geçmiştir. Bu plaka için test sonuçları, turuncu kuyucuklarda görüldüğü üzere çok sayıda doku reaktif ve IgG kontrol örneğinin başarısız olduğunu göstermektedir.

A1C one ve F1, TC skorunun parantez içinde belirtildiği bir TC doku reaktif hatasını gösterir; Wells B one ve E one ise sırasıyla yetersiz test antikoru veya test reaktifleri, BAG veya SPE kaynaklı iki tip IgG internal kontrol hatasını örnekler. Test plakası sonuçları, yalnızca sistem uygunluk kontrolü ve serum kontrolü burada gösterilen kabul kriterlerini karşıladığı takdirde yorumlanır. Türe özgü anti test serum immünoglobülin ile kaplanmış mikroküreler; yetersiz örnek eklenmesi, çok yüksek örnek dilüsyonu, yanlış tür veya immün yetmezliği olan bir konaktan alınan serumun test edilmesi nedeniyle başarısız skorlar gösterebilir.

Test denemesi analiz kontrol sonuçları tatmin ediciyse, bireysel analiz skorları aşağıdakilere göre sınıflandırılır. Bu prosedürün ardından, başlangıçtaki beklenmedik veya pozitif bulguları doğrulamak için ELISA, IFA ve/veya Western blot gibi ek yöntemler kullanmalıyız. Herhangi bir hayvan yönetimi kararı vermeden önce bu sonuçların doğrulanması kritik önem taşımaktadır.

Bu işlem, aynı örnek üzerinde farklı metodolojiler kullanarak veya aynı koloniden alınan ek örnekler yardımıyla gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, multipleks florometrik immünolojik analizinin nasıl yapılacağı ve tesisinizde elde edilen sonuçların nasıl yorumlanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu, her bir test örnek kuyucuğundan daha fazla bilgi toplarken iş gücünü azaltmanızı sağlayacaktır.