Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

Bu video, metillenmiş DNA immünopresipitasyonu veya meetup için bir protokolü göstermektedir. Bu yöntem, metillenmiş DNA'yı tarafsız bir şekilde spesifik olarak izole etmek için kullanılır. Memelilerde DNA metilasyonu, sitozinin C5 pozisyonuna bir metil grubunun eklenmesi ile karakterize edilir.

Bir CpG dinükleotidinde mevcut olduğunda, DNA metilasyonu hem normal gelişimde hem de çeşitli hastalık süreçlerinde önemli bir rol oynayan geri dönüşümlü bir epigenetik işarettir. DNA metilasyonunun normal işlevleri arasında dişilerde X kromozomu inaktivasyonu, tekrarlayan elementlerin susturulması, genomik imprinting ve genomik stabilitenin korunması yer alır. DNA metilasyonunun ayrıca kanser, de la Chapelle sendromu, Angelman sendromu ve immün yetmezlik, sentromerik instabilite ve yüz anomalileri sendromu gibi çok sayıda hastalıkta rol oynadığı gösterilmiştir.

Örneğin kanserlerde, anormal hipermetilasyon ve promotörler, hayati tümör baskılayıcı genlerin susturulmasıyla sonuçlanabilir. Uygunsuz hipometilasyon ise kromozomal instabiliteye ve onkogen aktivasyonuna yol açarken, işlem öncelikle DNA'nın 300 ile 1000 baz çifti arasında değişen boyutlarda fragmanlara sonikasyonla parçalanmasıyla gerçekleştirilir. Sonike edilen DNA daha sonra 95 degrees Celsius'ta denatüre edilir.

Beş primli metazin'i tanıyan primer antikorlar eklenir ve metillenmiş DNA fragmanlarına bağlanmalarına izin verilir. Primer antikor tarafından bağlanan DNA fragmanlarını izole etmek için manyetik dyna bead'lere konjuge edilmiş sekonder antikorlar kullanılır. Metillenmemiş fragmanlar uzaklaştırılır ve antikorlar proteinaz ile sindirilir.

KA fenil kloroform temizliği sindirilmiş proteini uzaklaştırır ve çöktürme işlemi, artık metillenmiş fragmanlar açısından zenginleşmiş olan DNA'yı saflaştırır. Ardından, DNA; PCR mikroarray ve sekanslama gibi uygulamalar için kullanılabilir. İşlem genellikle iki günlük bir prosedür olarak gerçekleştirilir.

Birinci gün DNA hazırlama, sonikasyon immünopresipitasyonu ve protein sindirimini içerir. İkinci gün, metilasyon açısından zenginleştirilmiş DNA'yı saflaştırmak ve izole etmek için pH kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesini içerir. Silikonize santrifüj tüpleri, bir DNA sonikasyon cihazı, primer antikor, anti-5' metil-CpG fare monoklonal antikoru, koyun anti-US IgG ile konjuge edilmiş sekonder antikor ve manyetik tüp rafı dahil olmak üzere kurulum için gereken birkaç özel materyal bulunmaktadır.

Meetup protokolündeki ilk adım DNA'nın hazırlanmasıdır. DNA'nın yapısının önceden değerlendirilmesi zorunludur. Örnek DNA'nın durumunun, öncelikle çift zincirli mi yoksa tek zincirli mi olduğunun bilinmesi gerekir; çünkü örneğin doğru şekilde miktarının belirlenmesi büyük önem taşımaktadır ve DNA miktarını belirlemeye yönelik çeşitli yöntemler, istenmeyen DNA türlerinin varlığından olumsuz etkilenebilir.

Çift sarmallı DNA miktarı, bir NanoDrop 3000 kullanılarak spektral fotometre ile kolayca değerlendirilebilir; 1.5 µL yükleyin ve ölçüm tipini nükleik asit olarak ayarlayın, hesaplama yöntemi olarak DNA 50'yi seçin ve cihazı 1.5 µL su ile başlatın. Pedestalları temizleyin ve cihazı 1.5 µL sıvı ile sıfırlayın. Örnek çözüldükten sonra pedestalları temizleyin, 1.5 µL örnek yükleyin ve ölç düğmesine basın.

Konsantrasyon verilecek ve kullanılabilir. İhtiyaç duyulan mikrolitre miktarını hesaplamak için, burada 1,8'lik bir A260/A280 oranı idealdir. 1 µg'lık bir örnek hazırlanır.

Bununla birlikte, başarılı sonuçlar elde etmek için 200 nanogram kadar az bir örnek yeterlidir. Hazırlık için, DNA örneğini temiz, silikonize bir tüpe yükleyin. Final hacmini 50 microliters seviyesine getirmek için yeterli miktarda steril su ekleyin.

DNA'nın ve proteinlerin tüp duvarlarına spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için DNA sonikasyonu ve immünopresipitasyon silikonlanmış tüplerde gerçekleştirilmelidir. DNA hazırlandıktan sonra, immünopresipitasyon daha küçük DNA fragmanlarıyla daha verimli olduğundan, DNA'yı fragmanlara ayırmak için numuneye sonikasyon uygulanmalıdır; numuneyi sonikatöre yerleştirin, güç ayarının yüksek olduğundan ve makinenin 30 saniye çalışma, 30 saniye bekleme şeklinde ayarlandığından emin olun. Tabanı, dolum çizgisine kadar 4 °C suya doldurun.

Numuneyi yedi dakika boyunca sonike edin. Sonikasyon işlemi tamamlandığında, tüpü çıkarın ve buza yerleştirin. Öngörülen numune ve DNA boyutuna göre sonikasyon koşullarını önceden optimize etmek önemlidir.

Örneğin, kısmen degrade olmuş bir DNA örneği daha kısa bir sonikasyon süresi gerektirecektir. Sonikasyon ürünleri standart elektroforetik tekniklerle görselleştirilebilir. Bu aşamada, daha sonra kullanılmak üzere uzunlukları 300 ile 1000 baz çifti arasında değişen DNA fragmanları istenir.

Mikrodizi ve PCR analizlerinde, DNA'nızın beşte birini girdi veya referans DNA olarak ayırmalısınız; bu durumda, immünopresipitasyon için 800 nanogram sonike DNA kullanılacak ve geri kalanı referans DNA olarak kenara ayrılacaktır. Medya protokolündeki bir sonraki adım immünopresipitasyon veya IP reaksiyonudur; primer antikor eklenmeden önce DNA denatüre edilmelidir. Primer antikor tek zincirli DNA'ya karşı duyarlı olduğu için denatürasyon gereklidir.

Numuneyi 95 °C sıcaklıktaki bir benmariye 10 dakika boyunca yerleştirin. Denatürasyon adımı tamamlandığında, tüpü derhal en az beş dakika boyunca buza aktarın. Bu işlem, denatüre olan DNA'nın yeniden bağlanmasını önleyecek ve numune soğuduğunda optimal antikor bağlanmasına olanak sağlayacaktır.

İçeriği dibe çöktürmek için tüpü kısa bir süre santrifüjleyin. Ardından, primer antikor eklenmelidir. Kullanılan antikor miktarı, her parti ve her üretici için titrasyonla belirlenmelidir.

Bu durumda, beş mikrogram primer antikor ekliyoruz ve ardından nihai hacmi 500 mikrolitreye tamamlayacak şekilde immünopresipitasyon tamponu veya IP tamponu ekliyoruz. Ardından, IP DNA bir rotatora yerleştirilir ve dört derece Celsius'ta iki saat boyunca inkübe edilmeye bırakılır. İnkübasyon sırasında tüp içerisinde antikor kümelenmesini önlemek için rotasyon gereklidir.

Birincil antikor inkübasyonu tamamlanmadan yaklaşık 15 dakika önce, manyetik dyna bead'leri temizleyin ve hazırlayın. İlk olarak, flakondaki bead'leri vorteksleyerek tamamen yeniden süspande edin. Ardından, 30 µL bead'i temiz bir silikonize tüpe aktarın ve bu tüpü çoklu reaksiyonlar için bir manyetik rafa yerleştirin.

Reaksiyon başına 30 microliters boncuk aktarın; pipetleme hatasını veya bazı boncukların istem dışı kaybını önlemek için bir ek reaksiyonluk miktar daha ekleyin. Örneğin, sekiz reaksiyon için dokuz reaksiyonluk boncuk veya 270 microliters miktarını alın.

Manyetik boncuklar, manyetik rafın duvarına doğru çekilecektir. Boncukların göç etmesi ve tüp duvarında belirgin bir şerit oluşturacak şekilde çökmesi için iki dakika bekleyin. Ardından, pipet ucuyla arka duvardaki boncukları rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı dikkatlice çekip atın.

Süpernatantı fazla miktarda IP tamponu ile değiştirin, vorteksleyin ve iki dakika boyunca tekrar manyetik rafa yerleştirin. Bu yıkama işlemini bir kez daha tekrarlayın ve yıkama boncuklarını orijinal IP tamponu hacminde yeniden süspande edin. İnkübasyon tamamlandığında numune tüpünü rotatörden çıkarın.

İmmünopresipitasyonu tamamlamak için reaksiyona 30 µL temiz boncuk ekleyin ve tüpü dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca tekrar bir rotatora yerleştirin. Bu inkübasyon sırasında, anti-fare IgG olan sekonder antikor, primer fare antikora bağlanacaktır. Anti-fare antikorları manyetik dyna boncuklara konjuge edilmiştir, bu da bağlanan ürünlerin kolayca geri kazanılmasını ve ardından gelecek saflaştırma adımını sağlar.

Her iki antikorla inkübasyon tamamlandığında, IP tüpünü iki dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Bu aşamada, metillenmiş DNA birincil antikor tarafından bağlanmış olacak ve bu birincil antikor da dyna bead konjuge ikincil antikor tarafından bağlanmış olacaktır. Süpernatantı uzaklaştırıp atın ve yerine 500 µL IP tamponu ekleyin.

Tüpün içeriğini karıştırın ve iki dakika boyunca tekrar rafa yerleştirin. Bu yıkama işlemini IP tamponu ile bir kez daha tekrarlayın. Son yıkamanın süpernatantını uzaklaştırdıktan sonra, boncukları son kez süspande edin.

400 µL sindirim Tamponu içerisinde, reaksiyonu 100 µg proteinaz K ile işleme tabi tutun ve 50 °C'de gece boyunca inkübe edin. Proteinaz K işlemi, antikor proteinlerini ve DNA ile ilişkili her türlü kalıntı proteini sindirmek için gereklidir ve böylece metillendi DNA'nın çözeltiye salınması sağlanır. DNA saflaştırması, buluşma prosedürünün ikinci gününde gerçekleştirilir; sindirim tüpünü inkübatörden geri alın.

Çeker ocak içerisinde, tüpe pH 7'de bire bir oranında fenol kloroformun 500 µL'sini ekleyin ve iyice vorteksleyin. Tüpü 13.000 ×g'de 10 dakika santrifüjleyin. Arayüzü bozmadan veya organik fazdan herhangi bir miktar almadan, üstteki sulu fazı tüpten dikkatlice alın. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.

Arayüz bulanık görünüyorsa ikinci bir ekstraksiyon yapılabilir. Ardından, üç molar sodyum asetatın onca hacmi, bu durumda 40 µL ekleyin. Pelet temizliğini kolaylaştırmak için taşıyıcı olarak 1 µL glikojen kullanılabilir.

İçeriği karıştırmak için tüpü vorteksleyin. Ardından iki hacim %100 etanol ekleyin, vorteksleyin ve dondurucuda -20 °C'de 20 dakika boyunca dondurun. Çökelen DNA, 13.000 G ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjle çöktürülür.

Tüpün dibinde bir DNA peleti oluşacaktır. Tüpü santrifüjden çıkarın ve etanolü uzaklaştırın. Tüpün dibindeki pelete zarar vermemeye dikkat edin.

Kalıntı Ethanol'ü uzaklaştırmak için kısa süreli bir santrifüj (pulse spin) gerekebilir. Peleti yıkamak için 500 µL soğuk, %70 ethanol ekleyip vorteksleyin ve 13,000 G'de, 4 °C'de 20 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. İkinci santrifüj işlemi tamamlandığında, %70 ethanol'ü kısa süreli santrifüj ile çöktürün ve kalıntı ethanol'ü bir pipet yardımıyla uzaklaştırın.

Peletin kuruması ve kalan etanolün buharlaşması için tüpü kapağı açık şekilde bir raf üzerinde bırakın. Son olarak, yalnızca metilasyon için zenginleştirilmiş DNA içeren peleti 10 µL steril su ile yeniden süspande edin ve kullanmadan önce DNA peletinin çözünmesi için yeterli süre tanıyın. Elde edilen verimin yeterliliğini PCR ile doğrulamak iyi bir uygulamadır.

Bu işlem, normal insan DNA primeri amplifikasyonu için metillenmiş ve metillenmemiş DNA fragmanlarını farklı şekilde gösteren ürünleri çoğaltmak üzere tasarlanmış PCR reaksiyonları yürütülerek gerçekleştirilebilir. H 19 imprinting kontrol bölgesi, genomun metillenmemiş bir bölgesini çoğaltmak için tasarlanmış primerlerle birlikte kullanılabilir. Örnek primer dizileri ve PCR döngü koşulları ekteki protokolde bulunabilir.

Bu noktada, meetup protokolünün başlangıcında ayrılan giriş veya referans DNA'sını geri almak gerekir. PCR reaksiyonlarının bir seti giriş DNA'sı kullanılarak, diğer seti ise metilasyon için zenginleştirilmiş IP DNA'sı kullanılarak kurulacaktır. Meetup başarılı olduysa, IP PCR metilasyon primerleri kullanılarak bir ürün oluşturacak ve kontrol primerleri kullanılarak hiçbir ürün oluşturmayacaktır.

Aksine, girdi PCR'ı hem metillenmiş hem de metillenmemiş DNA fragmanlarını içerdiğinden, her iki primeri kullanarak ürünler üretmelidir. Metillenmiş fragmanlar açısından zenginleştirilmiş DNA; PCR dizileme ve mikroarray analizi gibi bir dizi alt uygulama için kullanılabilir.

Diğer moleküler biyoloji teknikleriyle entegre edildiğinde, metilasyon profilleme yapmak veya Epigenomiği incelemek amacıyla, DNA'nın metilasyon durumunun lokusa özgü veya genom genelinde araştırılması için kullanılabilir.