Programlanabilir Çektirme Patch-pipetler ve Sharp Elektrotlar

Cam kılcal pipetler; tek hücreli elektroporasyon, DNA mikroenjeksiyonu ve patch clamp elektrofizyolojisi gibi çok çeşitli teknikler için laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kayıtlar için cam kılcal patch clamp elektrotlarını hazırlamak amacıyla, programlanabilir bir çekici cihazda silikat cam çekilir. Elektrot uçları balmumu ile kaplanır, ardından uçlar ateşle cilalanır ve gelecekteki kullanımlar için saklanır. Merhaba, ben Stanford Üniversitesi Moleküler ve Hücresel Fizyoloji Bölümü'nden Miriam Goodman.

Bu videoda, elektrofizyoloji için patch clamp pipetlerinin ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını göstereceğim. Pipetler olarak da adlandırılan cam mikroelektrotlar, onlarca yıldır elektrofizyolojinin temel araçları olmuştur. Günümüzde bu pipetler, programlanabilir bir çekici kullanılarak cam kılcal borulardan imal edilmektedir.

Hadi başlayalım. Patch clamp pipetleri hazırlamak için temiz ve tozsuz olan Sutter borosilikat kapilerler ve Sutter P 97 alevli taşlamalı mikro elektrot çekici kullanıyoruz. Sutter'ın Pipette Cookbook'u, uygun çekme programları geliştirmek için mükemmel bir referanstır.

Başlamak için, çekicinin üzerindeki toz kapağını kaldırın. Ardından kutudan bir adet cam kapiler tüp alın. Toz birikimini en aza indirmek için kapağı tekrar kapatmayı unutmayın.

Ardından, bir elinizle kapiler tüpü filamentin bir yanındaki yuvaya kaydırın ve kelepçeyi hafifçe sıkın. Bu aşamada kelepçe, tüpün düşmesini engelleyecek kadar sıkı, ancak tüpü yuva içine kaydırabileceğiniz kadar gevşek olmalıdır. Şimdi, aynı taraftaki yaylı metal durdurucuyu serbest bırakın.

Ardından başparmağınız ve işaret parmağınızla her iki taşıyıcının altına takılı olan metal sekmeleri kavrayın. Diğer yaylı metal durdurucuyu serbest bırakın. Taşıyıcıları gidebildikleri kadar birbirine doğru çekin ve bir elinizle yerinde tutun.

Ardından, tüpü filament yuvasından geçirerek diğer taraftaki taşıyıcının kanalına yerleştirin. Camın ısıtma filamentine itilmemesine dikkat edin. Her iki taraftaki kelepçeleri sıkın.

Taşıyıcıları yerinde tutacak kadar sıkı olmalı, ancak camı kıracak kadar sıkı olmamalıdır. Şimdi, toz kapağını kapatın ve yeşil düğmeye basın. Patch clamp kayıtları için işaretli uçlu pipetler, her adımda azalan ısı ve hızla uygulanan beş adımlı bir çekme programı ve son adımda oluşturulan küçük bir uç kullanılarak hazırlanır.

Bu program ısı ve yerçekimini kullanır. Sivri elektrotlar hazırlama prosedürü çok benzerdir, ancak bu durumda dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,78 mm olan Warner Instruments marka ince cam kılcal boru kullanıyoruz. Ayrıca, çekme programları tamamlandığında, ısı ve yerçekimine ek olarak bir motor kullanan bir çekme programı uyguluyoruz.

Toz kapağını kaldırın, her iki kelepçeyi gevşetin ve tamamlanmış pipeti çıkarın. Ardından pipetleri bir çalışma kutusuna yerleştirin. Kutu, plastik bir pipet ucu kutusunun rafına bir sünger şeridinin yapıştırılması ve ardından süngere altı ila sekiz adet yarık açılmasıyla hazırlanabilir.

Pipetleri yuvalara yerleştirin. Kutu çekilmiş pipetlerle dolduğunda, pipetleri ateşle cilalamak için ateşle cilalama adımına geçin. Ateşle cilalama işlemine başlamadan önce, ayak pedalıyla kontrol edilen platinyum bir ısıtma filamentine sahip bir mikro ocak düzeneği kurun.

Kapasitansı azaltmak ve gürültü karakteristiklerini iyileştirmek için önce pipeti diş hekimi mumu ile kaplayın. Bunu yapmak için, yakınınızda küçük bir miktar eritilmiş mum bulundurun. Mumun uca girmesini önlemek için pipetin arka kısmından hava basıncı uygulayın.

Ardından ucu kısa bir süre sıvı muma daldırın ve hemen çıkarın. Pipeti parlatma düzeneğine yerleştirin ve ucu filamente yaklaşık 50 mikron mesafe gelecek şekilde yaklaştırın.

Filamanın ısıtıldığında genişleyeceğini unutmayın. Pipetin ucundaki mumu temizlemek ve camı düzeltmek için bir veya iki saniyelik kısa bir ısı darbesi uygulayın. Açıklık çapını ve pürüzsüzlüğünü belirlemek için pipet uçlarını bir mikroskop altında inceleyin.

Standart patch clamp kayıtları için uç açıklıkları bir ila üç mikron çapında olmalıdır; pürüzlü, düzensiz veya heterojen uçları atın. Hazırlanan pipeti, pipetleri tozdan korumak için kapağı kapattığınızdan emin olarak bir çalışma kutusuna yerleştirin ve 10 başarılı pipet elde edene kadar işlemi tekrarlayın. Size programlanabilir bir çekici kullanarak patch clamp pipetleri ve keskin elektrotların nasıl hazırlanacağını göstermiş oldum.

Aynı prosedür, optimal patch clamp sonuçları için enjeksiyon iğneleri dahil olmak üzere çeşitli cam araçların yapımında kullanılabilir. Yeni, tozsuz pipetlerin deney gününde çekildiğini ve deneyden önceki bir saat içinde parlatıldığını hatırlamak önemlidir. Ayrıca pipetlerin pürüzsüz ve parlatılmış olduğunu gözle muayene ederek doğrulayın.

Opus oositlerde eksprese edilen iyon kanallarının patch clamp kaydının nasıl yapılacağını gösteren diğer videomuzu izlediğinizden emin olun. Tamam, işte bu kadar. Artık bir pipet uzmanısınız, deneylerinizde başarılar dileriz.