تحليل فسلجي المتداول كريات بيضاء E - Selectin بوساطة بطانة الاوعية الدموية الدقيقة في

يوضح هذا الفيديو تحليل غرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية لفحص العوامل التي تحفز تدحرج الكريات البيضاء على أسطح الخلايا البطانية. يتم تحفيز الطبقات الأحادية من الخلايا البطانية باستخدام السيتوكين المسبب للالتهابات IL one beta لزيادة تعبير S selectin. بعد ذلك، يتم وضع غرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية فوق الخلايا البطانية، ويتم ضخ الكريات البيضاء الموجبة لـ S selectin فوق الطبقة الأحادية.

وبذلك تتعرض التفاعلات الخلوية في الحجرة لإجهاد قص مشابه لذلك الذي يحدث أثناء التصاق الكريات البيضاء في الشعيرات الدموية بعد الشعيرية. يتم رصد أحداث التدحرج وتعدادها باستخدام عناصر NIS واختبار استقلالية E select. مرحباً، أنا جورج ويز من مختبر الدكتور تشارلز دي نيترو في قسم الجلدية بمستشفى بريغهام للنساء، كلية الطب بجامعة هارفارد.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل دور e selectin وربائط E selectin في التصاق الكريات البيضاء البشرية بالخلايا البطانية لنخاع العظم البشري تحت ظروف تدفق الدم الفسيولوجية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دور جزيئات سطح الخلية التي تبدأ التصاق خلايا الدم البيضاء أو الخلايا السرطانية النقيلية بالخلايا البطانية التي تبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية. وتتميز عملية الالتصاق هذه بسلوك تدحرج يشبه تدحرج كرة البولينج في الممر.

لنبدأ الآن. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تحضير الخلايا البطانية التي ستغطي غرفة التدفق. يستخدم هذا البروتوكول خلايا H-B-M-E-C 60 المشتقة من نخاع العظم البشري.

يجب طلاء أطباق زراعة الأوعية الدموية الدقيقة مسبقاً بالفبرونيكتين؛ ولتحضير ذلك، تُحضن أطباق زراعة الأنسجة سعة 35 milliliter بمحلول PBS يحتوي على 20 micrograms per mil من الفبرونيكتين. ويمكن تحضينها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C أو لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 37 °C. يتم تعليق خلايا H-B-M-E-C 60 في الوسط medium 1 99 وزراعتها بكثافة 10^5 خلية لكل طبق، وتُنمى المزارع حتى تتجاوز نسبة الالتحام 90%.

سوف يستغرق ذلك حوالي يومين لتحفيز تنظيم e selectين ورفع مستوى تعبيره؛ قم بشفط وسط النمو وإضافة وسط جديد يحتوي على 50 nanograms per mil من IL one beta ثم قم بالتحضين لمدة تتراوح من أربع إلى ست ساعات. الآن أصبحت الطبقات الأحادية من الخلايا جاهزة لاختبار غرفة التدفق. يمكن تحفيز أطباق إضافية من خلايا H-B-M-E-C 60 باستخدام IL one beta ومعالجتها بجسم مضاد معادِل لـ e selectin البشري بتركيز 20 micrograms per mil لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees Celsius.

سيُستخدم هذا كعنصر تحكم للتعبير الوظيفي لـ e selectin. بعد ذلك، قم بتحضير الكريات البيضاء الإيجابية لـ e selectin، وهي عبارة عن KG one، وهي خلايا سلف دمويّة بشرية.

تُزرع هذه الخلايا في معلق حتى تصل إلى مرحلة التلاقي أو بكثافة 6 × 10⁶ خلية/مل في وسط RPMI 1640. يمكن سحب خلايا KG-1a مباشرة من المزرعة وعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). أعد تعليق الخلايا بكثافة 10⁶ خلية/مل في محلول HBSS مع 10 millimolar HEPES أو محلول منظم HH يحتوي على 2 millimolar كلوريد الكالسيوم.

تُحفظ الخلايا على الثلج حتى يحين وقت التحليل. تتضمن الخطوات التالية تجهيز المجهر، وغرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية، ومضخة الحقنة. وبدءاً من مرحلة التحليل، يتم تشغيل المجهر ومضخة الحقنة.

اختر العدسة الشيئية ذات التكبير 10x في المجهر. ضع أنبوبة مخروطية سعة 50 milliliter في الحامل واملأها بـ HH buffer يحتوي على calcium chloride بتركيز two millimolar. ثم ضع أنابيب اختبار بلاستيكية سعة five milliliter في الحامل أدناه.

بعد ذلك، ضع محقنة سعة 60 مل في مضخة المحاقن. تأكد من تثبيت كل من مكبس المحقنة وجسمها بإحكام. قم بتوصيل صنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات بنهاية المحقنة سعة 60 مل، ثم وصل محقنة سعة 5 مل بالصنبور ثلاثي الاتجاهات.

ضع جهاز غرفة التدفق المتوازي على منصة المجهر بحيث يكون أنبوب الإدخال على اليمين وأنبوب الإخراج على اليسار وأنبوب التفريغ في الخلف. بعد توصيل الأنابيب بجهاز التفريغ، افتح صمام الهواء للسماح لجهاز الألواح المتوازية بالالتصاق بالمنصة. سيؤدي ذلك إلى اختبار ما إذا كانت حاشية التفريغ الموجودة في غرفة التدفق محكمة الإغلاق.

عندما يتم التأكد من إحكام الغلق، أغلق صمام الهواء. الآن قم بتوصيل خط أنبوب المخرج بصنبور الإيقاف ثلاثي الاتجاهات المتصل مسبقاً بالمحقنة. أصبح الجهاز الآن جاهزاً لوضعه فوق خلايا H-B-M-E-C 60.

قم بتشغيل المكنسة الكهربائية (vacuum) ثم خفّض جهاز غرفة التدفق برفق فوق الطبق واترك الجهاز يقوم بعملية الشفط. يجب ألا يكون هناك أي صوت لتسرب الهواء، وفي هذه المرحلة قد تحتاج إلى الضغط على الغرفة لضغط الحشية المطاطية. وبمجرد استقرار الشفط، ضع أنبوب الإدخال في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

افتح صمام الإيقاف ثلاثي الاتجاهات المتصل بالمحقنة سعة 60 mil واضبط المضخة على وضع الضخ لإزالة الهواء من الخطوط دون رفع الخلايا الموجودة على الطبق. استخدم مضخة المحقنة المضبوطة على سرعتين mil في الدقيقة لملء أنبوب السحب. ثم قم بضبط السرعة بسرعة على 0.5 mil في الدقيقة.

قبل وصول السائل إلى الجهاز مباشرةً، من الضروري تهيئة النظام بعناية وتجنب تكون فقاعات الهواء، والتي من شأنها أن ترفع الطبقة الأحادية عن الصفيحة. وبمجرد انتقال السائل إلى المحقنة سعة 60 mil، تكون غرفة التدفق ومضخة المحقنة قد تمت تهيئتهما. الآن، قم بتثبيت غرفة التدفق على المنصة باستخدام قطعة من الشريط اللاصق فوق كل من خطوط الإدخال والإخراج وخط التفريغ.

يضمن ذلك بقاء مجال الرؤية ثابتاً عند تصور البيانات وجمعها. غرفة التدفق الآن جاهزة للاستخدام. يجب تكرار هذه الخطوات لكل عملية إدخال للخلايا ولكل طبق جديد.

لالتقاط أحداث التدحرج في موقع Lucas، افتح برنامج NIS elements على سطح المكتب، واضغط على أيقونة التشغيل للحصول على صورة مباشرة. سيسمح لك التعريض الضوئي التلقائي برؤية الطبق وتركيز الصورة. تأكد من تركيز المجهر بشكل صحيح على الطبقة الخلوية الأحادية عن طريق ضبط التركيز يدويًا في المجهر.

بمجرد ضبط تركيز الصورة، أعد ضبط التعريض الضوئي ليكون إطاراً واحداً في الثانية وقم بتعديل الإضاءة في المجهر. يجب أن تظهر الصورة على جهاز الكمبيوتر وألا تعود مرئية في المجهر. يمكن بعد ذلك ضبط المدرج التكراري للضوء؛ ولإزالة التعريض الخلفي أو لتحسين وضوح الخلايا، انقر على "two by two bin" أو "live bin" للحصول على صورة مثالية لتصوير الفيديو.

انقر فوق "macro" في شريط القائمة واختر "right to port"، ثم اختر المنفذ "com three" واضغط على "open". سيؤدي ذلك إلى فتح المنفذ للتنسيق مع مضخة السرنجة. غرفة التدفق الآن جاهزة لحقن خلايا KG-1a؛ استخدم الماصة لنقل 1 ml من معلق خلايا KG-1a إلى أنبوب اختبار سعة 5 ml الموجود بالقرب من خط أنبوب الإدخال.

ثم ضع خط الإدخال في قاع أنبوب الاختبار. انتقل إلى شريط القوائم وانقر على الالتقاط والاستحواذ بفاصل زمني. اختر البروتوكول الذي تستغرق مدته 210 seconds.

هذا هو طول البرنامج الخاص بالتدحرج على خلايا H-B-M-E-C 60. وقد تم برمجة كل مرحلة لالتقاط صورة كل ثانية طوال مدة بروتوكول المضخة. كما تم إعداده لإرسال أمر عبر منفذ الاتصال الثالث (comm three) لبدء تشغيل المضخة.

اضبط مضخة الحقنة على وضع البرنامج، مما يسمح بالبرمجة اليدوية لمعدلات تدفق محددة. سيحدد هذا مستويات إجهاد القص داخل الغرفة ويتحكم في تفاعلات خلايا KG one A فوق خلايا H-B-M-E-C 60. الإعدادات لهذه التفاعلات هي 4.2 dines per centimeter squared لمدة 45 seconds.

تُضبط القوة عند 3 dines per centimeter squared لمدة 60 ثانية، ثم تزداد الخطوات بمعدل زيادة كل 15 ثانية وصولاً إلى حد أقصى يبلغ 4.2 dines per centimeter squared. الآن أصبح المجهر والكمبيوتر جاهزين لالتقاط صور الفاصل الزمني. اضغط على "بدء التشغيل" (start run) في الكمبيوتر لبدء الحصول على البيانات أثناء تشغيل البرنامج.

تأكد من إضافة الوسط الغذائي إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا KG one A من أجل إبقاء أنابيب الإدخال والإخراج ممتلئة بالوسط ومنع دخول فقاعات الهواء إلى النظام. في حال انقطاع التصوير المتقطع (time lapse)، لن تتوقف المضخة من تلقاء نفسها ويجب إعادة ضبطها. اضغط على "إلغاء" للعودة إلى الصورة المباشرة.

تُستخدم طبقة أحادية من الخلايا البطانية غير المحفزة كضابط سلبي لهذه التجربة. وللقيام بذلك، يتم ضخ كريات دم بيضاء من نوع KG-1A في غرفة التدفق فوق خلايا HBMEC-60 غير المعالجة للتحقق من استقلالية E-selectin، ثم يتم تحفيز الطبقة الأحادية للخلايا البطانية باستخدام IL-1β وضخ الكريات البيضاء فوق هذه الخلايا لمزيد من التحقق من استقلالية التأثير. وتُعالج خلايا HBMEC-60 بـ IL-1β ثم بجسم مضاد مضاد لـ S-selectin البشري.

ثم قم بتحليل أحداث تدحرج الكريات البيضاء على هذه الخلايا. لا يتحدد تدحرج الخلايا بواسطة S selectin فحسب، بل أيضاً بواسطة بقايا حمض السياليك على سطح خلية الكريات البيضاء. ولإثبات ذلك، قم بهضم خلايا KG one A باستخدام 0.1 units per mil من neuraminidase لمدة ساعة واحدة عند 37 °C.

بعد ذلك، قم بتحليل أحداث التدحرج فوق خلايا H-B-M-E-C 60 المحفزة. وتعد البروتينات السكرية الموجودة على سطح الكريات البيضاء مهمة أيضًا لتدحرج الخلايا، ويمكن إثبات ذلك عن طريق معالجة خلايا KG one A بـ 0.2 units per mil من broma lane لمدة ساعة واحدة عند 37 °C، ثم حقنها في غرفة التدفق.

بعد الحصول على التسلسل الزمني، تصبح البيانات جاهزة للتحليل. احفظ البيانات ثم انتقل إلى علامة تبويب القياس (measure) في شريط القائمة واختر العتبة المحددة (defined threshold). حرك الأشرطة بحيث يتم تلوين الخلايا المطلوبة باللون الأحمر، ثم حدد جميع الصور واضغط موافق؛ من المفترض الآن أن يتم تعديل تسلسل التصوير الزمني بالكامل بحيث تظهر الخلايا المتدحرجة باللون الأحمر.

انتقل إلى "قياس" (measure) واختبر "القيود" (restrictions). يتيح ذلك للمستخدم استبعاد الأجسام التي تتجاوز العتبة والتي لا تمثل الخلايا المتدحرجة. وتتمثل هذه الأجسام أساساً في الخلفية الناتجة عن منطقة اختيار الطبقة أحادية الخلايا من H-B-M-E-C 60؛ قم بإدخال القيم الدنيا والقصوى التي تعتبر مثالية لكريات الدم البيضاء المتدحرجة.

كرر هذه الخطوة لعمليتي الاستطالة والدائرية. اختر measure ثم اختر create binary using restrictions. ستُستخدم الآن قيم التقييد نفسها، التي تم تعيينها في الخطوة السابقة، لتحسين برنامج NIS elements من أجل التعرف على الكريات البيضاء المتدحرجة على الطبقة الأحادية للخلايا البطانية. عد إلى measure واختر field data ثم اختر reset data.

أغلق القائمة، وارجع إلى القياس (measure) وحدد حقل المسح (scan field)، ثم افتح بيانات حقل القياس (measure field data)، وحدد عدد الكائنات (number of objects). بعد ذلك، حدد جميع الحقول وقم بتصدير البيانات إلى برنامج Microsoft Excel. وأخيراً، اختر مسح البيانات (clear data).

أصبحت عناصر NIS الآن جاهزة لجمع المزيد من البيانات. تُظهر هذه البيانات التمثيلية كيف تستجيب التفاعلات بين الكريات البيضاء والخلايا المبطنة للأوعية الدموية لإجهاد القص الفسيولوجي، وتحديداً من خلال اختبار دور الربيطة اللاصقة E selectin.

يحدث تدحرج قوي لخلايا الكريات البيضاء عندما يتم تحفيز الخلايا البطانية مسبقاً بواسطة IL-1β. وعند مقارنة هذه النتيجة بالمجموعة الضابطة غير المحفزة، يتضح أن تدحرج الخلايا يعتمد على التحفيز بالسيتوكين. ومن خلال معالجة خلايا HBMEC-60 بواسطة IL-1β ثم باستخدام جسم مضاد لـ E-selectin البشري، يصبح من الواضح أن تدحرج الخلايا يعتمد تحديداً على E-selectin.

يمكن استخدام هذا المقايسة لاختبار معاملات أخرى أيضاً. فعلى سبيل المثال، عندما يتمت معالجة الخلايا المُحفزة مسبقاً بـ sase أو بـ brolin، تكون النتائج أقل قوة. وتسلط هذه البيانات الضوء على أهمية بقايا حمض السياليك الطرفية بالإضافة إلى البروتينات السكرية الموجودة على سطح الخلية.

بالنسبة لنشاط ربيطة السلكتين S، لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تحليل التفاعلات الالتصاقية القائمة على السلكتين e بين الكريات البيضاء والخلايا البطانية في ظل ظروف تحاكي القوى الموجودة في الوريد ما بعد الشعيري، وهي منطقة في الجهاز الدوري حيث تغادر الكريات البيضاء الدم وتدخل الأنسجة. عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر استخدام الجسم المضاد الحاجب المناسب أو التحكم في المعالجة الإنزيمية للتحقق من ضرورة السلكتين المعني وربيطته في نظام المقايسة هذا. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.