دراسة مسارات المتداول على أنماط الخلية المستقبلة المتناظر
فبراير 13, 2011
نحن تصف وضع بروتوكول لمراقبة وتحليل الخلية المسارات المتداول على ركائز مستقبلات نقوش غير المتماثلة. البيانات الناتجة هي مفيدة للهندسة من مستقبلات منقوشة ركائز للتسمية خالية من فصل الخلية وتحليلها.
يرصد هذا البروتوكول ويحلل مسارات تدحرج الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة لتسهيل هندسة ركائز أنماط المستقبلات من أجل فصل الخلايا وتحليلها دون استخدام واسمات؛ يبدأ ذلك بطباعة مجهرية تلامسية لجزيئات PEG على ركيزة ذهبية لإنشاء أنماط متبادلة من الطبقات أحادية الجزيئات ذاتية التجميع، يلي ذلك ملء الفراغات في الركيزة بمستقبلات P select. بعد ذلك، يتم دمج الركيزة مع غرفة التدفق. ثم يتم تدفق خلايا HL 60 داخل الغرفة.
قم بتسجيل تسلسل صوري للتفاعل التدحرجي لخلايا HL 60 على أنماط P selectin، وقم بتحليل الصور المحولة من الفيديو. يمكن الحصول على مسارات تتبع حواف الخلايا المتدحرجة، وطول التدحرج، وسرعات التدحرج على المستوى، والمنطقة، والحافة باستخدام برنامج MATLAB. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية حول كيفية تحرك خلايا HL 60 على أنماط المستقبلات غير المتماثلة في تدفق القص.
يمكن تطبيق ذلك لقياس التفاعلات السطحية للخلايا الأخرى كمياً، والتحليل المباشر للخلايا من خلال مراقبة مساراتها على أنماط المستقبلات، وكذلك لتصميم أجهزة التثبيت الدقيقة لفصل الخلايا. تُستخدم الطباعة بالتلامس الدقيق لإنشاء أنماط متبادلة من الطبقات أحادية الجزيء ذاتية التجميع من جزيئات peg على الركيزة الذهبية.
أولاً، قم بتحبير ختم PDMS بمحلول PEG بتركيز 5 millimolar في الإيثانول. جفف السطح لمدة 20 دقيقة. ضع الختم برفق على سطح الذهب لمدة 40 ثانية مع التأكد من وجود تلامس جيد بين سطح الذهب والختم.
لا يلزم وجود ضغط إضافي. اشطف السطح بالإيثانول وجففه تحت تيار من النيتروجين. الآن، وباستخدام غرفة تروية، قم بتحضين الركائز مع محلول P selectin بتركيز 15 micrograms per milliliter لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة لتشكيل الأنماط في المناطق المتبقية بواسطة P selectin، ثم اشطف الغرفة، وبعد ذلك املأ الأسطح بـ BSA بتركيز one milligram per milliliter لمدة ساعة واحدة لمنع التفاعلات غير النوعية.
اشطف السطح بمحلول DPBS المنظم قبل إجراء تجربة تدحرج الخلايا. قم بتجميع غرفة التدفق، ثم مرر معلقاً من خلايا HL 60 بتركيز 10⁵ خلية/مل فوق الأسطح ذات الأنماط في غرفة تدفق مستطيلة بزوايا ميل لنمط المستقبلات تبلغ 10 درجات.
في درجة حرارة الغرفة البالغة 24.5 °C. اضبط مضخة السرنجة لتوليد معدل تدفق قدره 75 µL/min مع إجهاد قص صفائحي مقابل قدره 0.5 dyn/cm². الآن، باستخدام مجهر مقلوب وكاميرا مثبتة، قم بتسجيل تدحرج خلايا HL 60.
التفاعلات مع p-select adhesive والركائز. باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 4x وبمعدل إطار واحد في الثانية لمدة 300 ثانية. يتم إجراء ثلاث تجارب مستقلة.
اعرض البيانات كمتوسط وانحراف معياري للقيم المتوسطة التي تم الحصول عليها من كل تجربة. صور مجهرية مستخرجة من فيديو HL 60.Rolling. تظهر التفاعلات مع p-selectin اللاصق والركائز مناطق مضيئة ومظلمة تقابل مناطق مستقبل p-selectin ومناطق PEG على التوالي.
يتم تحديد المسارات هنا باستخدام برنامج MATLAB مخصص. بلغت زاوية ميل الحافة 10 درجات، وكان إجهاد القص 0.5 dines لكل سنتيمتر مربع. وتستند التحليلات الإضافية إلى توزيع طول تتبع الحافة، والقيمة المتوسطة لطول تتبع الحافة، بالإضافة إلى VE و VP، وهما سرعات التدحرج على حافة النطاقات وداخلها.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص مسارات الخلايا على أنماط المستقبلات غير المتماثلة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يرصد هذا البروتوكول ويحلل مسارات تدحرج الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة لتسهيل هندسة ركائز أنماط المستقبلات من أجل فصل الخلايا وتحليلها دون استخدام واسمات.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- المواد الحيوية
- الموائع الدقيقة
خلفية علمية
- يُعد تدحرج الخلايا عملية بالغة الأهمية في مختلف التفاعلات البيولوجية.
- يمكن لأنماط المستقبلات غير المتماثلة أن تؤثر على سلوك الخلية.
- تعتبر التقنيات الخالية من الوسوم أساسية لفصل الخلايا وتحليلها.
- يُعد الطباعة بالتلامس الدقيق طريقة مفيدة لإنشاء ركائز منقوشة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لمراقبة تدحرج الخلايا على ركائز ذات أنماط مستقبلية.
- تحليل مسارات الخلايا المتدحرجة لتحسين هندسة الركائز.
- تقديم رؤى حول ديناميكيات حركة الخلايا تحت ظروف التدفق.
الطرق المستخدمة
- الطباعة بالتلامس الدقيق لجزيئات PEG على ركيزة ذهبية.
- إنشاء أنماط متبادلة من الطبقات أحادية الجزيئات ذاتية التجميع.
- ملء الفراغات في الركيزة باستخدام P-selectin والمستقبلات.
- دمج غرفة التدفق وتصوير خلايا HL-60 وهي تتدحرج على الأنماط.
النتائج الرئيسية
- تم تسجيل تسلسلات صور لتفاعلات خلايا HL-60.
- حُللت مسارات الخلايا المتدحرجة باستخدام برنامج MATLAB.
- تم الحصول على بيانات حول طول تتبع الحواف وسرعات التدحرج.
- قُدمت رؤى حول حركة الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول تحليلاً تفصيلياً لديناميكيات تدحرج الخلايا.
- يمكن هندسة أنماط مستقبلات غير متماثلة لتحقيق فصل فعال للخلايا.
- تساهم هذه الطريقة في فهم سلوك الخلايا في تدفق القص.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
إن فهم مسارات تدحرج الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة يتيح التصميم العقلاني لأجهزة الفصل الموائع دقيقة الخالية من الوسوم. يوفر هذا البروتوكول بيانات كمية حول طول تتبع الحواف وسرعة التدحرج تحت إجهاد قص محدد، مما يدعم النمذجة التنبؤية لسلوك الخلايا في التدفق. وتساهم هذه الرؤى في تقليل التكرار التجريبي في هندسة الأجهزة المستخدمة في سير عمل تنقية الخلايا والتحليل المظهري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء حركية ارتباط الربيطة بالمستقبل تحت تأثير قص فسيولوجي، مما يساهم في التحقق من صحة الأهداف للمسارات التي تتوسطها عملية الالتصاق.
- القيمة التشغيلية: يوفر طريقة خالية من الوسوم لتقييم النشاط الوظيفي للمستقبل دون الحاجة إلى علامات فلورية أو مراسلين جينيين.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد قراءات كمية لسرعة تدحرج الخلايا وطول تتبع الحواف لإجراء تحليل مقارن عبر كثافات المستقبلات أو هندسة الأنماط.
- القيمة التشغيلية: توحيد معايير تحضير الركيزة عبر الطباعة بالتلامس الدقيق والتكامل مع غرفة التدفق لضمان تكرارية اختبارات الالتصاق.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية لاستراتيجيات الفصل القائمة على الالتصاق من خلال ربط تصميم نمط المستقبلات بنتائج مسار الخلايا الملحوظة.
- القيمة التشغيلية: يتيح فحص الأنماط الظاهرية للخلايا بناءً على سلوك التدحرج، وهو أمر مفيد لإثراء المجموعات الفرعية في النماذج قبل السريرية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن مراحل الاكتشاف المبكرة لتوجيه تطوير المقايسات وإنشاء الأدوات قبل السريرية، ولا سيما بالنسبة للأهداف التي يكون فيها الالتصاق تحت التدفق بمثابة قراءة وظيفية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات المتعلقة بتفاعلات المستقبل-الربيطة في تدفق القص، مما يوضح المساهمات الميكانيكية في تدحرج الخلايا.
- الفحص: توفر مقاييس التصاق كمية وموحدة تتيح مقارنة الخطوط الخلوية أو معدلات المستقبلات.
- التحليلات: تستخرج توزيعات طول تتبع الحواف وسرعة التدحرج، مما يوفر أساسًا إحصائيًا لمقارنة الظروف.
- الأبحاث الانتقالية: تربط ديناميكيات التدحرج في المختبر بالفائدة المحتملة في أجهزة فصل الخلايا الخالية من الوسوم لمعالجة العينات قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم سلوك الخلايا بوساطة الالتصاق عبر أهداف وأنواع خلوية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في آليات الفصل القائمة على الالتصاق من خلال قياس معلمات المسار تحت تأثير قص متحكم به.
- القيمة التشغيلية: تضمن قابلية التكرار من خلال توحيد عمليات الطباعة بالتلامس الدقيق، وملء مستقبلات الخلفية، وإعداد غرفة التدفق.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من تطوير الجهاز عن طريق تمكين التحقق الوظيفي المبكر من أنماط المستقبلات.
- تأثير المحفظة: تدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف فيما يتعلق بتقنيات الفصل بالمائعيات الدقيقة من خلال توفير بيانات تجريبية عن أداء الأنماط.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الطباعة بالتلامس الدقيق، وكيمياء الأسطح، والتحكم في التدفق ميكروفلويديك.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى المجهر ذو المجال المضيء المقلوب، وكاميرا عالية السرعة، وأدوات تتبع الجسيمات القائمة على MATLAB.
- يستلزم توحيد معايير تصنيع الركيزة وإعداد تقارير ظروف التدفق عبر الفرق لضمان إمكانية التكرار في مواقع متعددة.
- يتطلب التكيف مع أنواع خلايا بديلة التحقق من أزواج الرابط-المستقبل وتحسين معاملات إجهاد القص.
- يقتصر بسبب الطبيعة العابرة للتفاعلات عند حواف الخلايا، مما يحد من إعادة بناء المسار الكامل ويستلزم تحليلاً مجزأً.
