معالجة Loblolly باين PtGen2 ميكروأري [كدنا]

أُنتج هذا الفيديو من قبل باحثين في مدرسة وارنيل للغابات والموارد الطبيعية بجامعة جورجيا. الغرض من هذا الفيديو التدريبي هو تفصيل كيفية معالجة مصفوفة LOB lolly pine pt، gen two CDNA، مع إيلاء اهتمام خاص لعمليات غسل المصفوفة والتعامل معها، وذلك قبل التهجين وبعده. وبشكل عام، تتبع بروتوكولاتنا تلك التي تم تطويرها في معهد الأبحاث الجينومية Tiger ومرفق موارد المصفوفات الدقيقة المشترك في فاندربيلت (VMSR)، حيث يتم طباعة مصفوفاتنا.

لقد وجدنا أن معالجة PT Gen two بشكل أكثر صرامة مطلوبة لضمان تحقيق أقصى قدر من الاتساق فيما يتعلق بزيادة توحيد جودة الإشارة وخفض مستويات الخلفية. تتمثل الخطوة الأولى في الغسل المسبق؛ ونقوم بذلك لأن محلول التثبيت الخاص بنا يحتوي على محتوى ملحي عالٍ جداً، وهذا الغسل المسبق ضروري لإزالة هذا الملح.

توضع الشرائح في حامل شرائح المجهر وتُغمس بقوة من 15 إلى 20 مرة في محلول 0.2%SDS تم تسخينه مسبقاً إلى 43 درجة. بعد غسل الشرائح في محلول SDS، تُنقل بعناية باستخدام ملقط إلى جرة Copeland تحتوي على محلول منظم لما قبل التهجين. يحتوي هذا المحلول المنظم على five XSSC و0.1%SDS و1%BSA، ويتم تسخينه أيضاً عند 43 درجة.

تُغطى جرة كوبلاند بـ parfum وتوضع في حاضنة عند درجة حرارة 43 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد التهجين المسبق، تُنقل الشرائح إلى حامل شرائح المجهر وتُعالج بالتتابع من خلال خمس تغييرات من الماء منزوع الأيونات، مع غمرها من 15 إلى 20 مرة في كل تغيير. وفي النهاية، توضع الشرائح في isopropanol وتُغمس خمس أو ست مرات قبل إجراء عملية الطرد المركزي لها حتى تجف باستخدام جهاز طرد مركزي chip M mate.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم نفخ الشرائح بهواء مضغوط ممرر عبر مرشح بمسامية 0.2 micron. ثم تُغطى الشرائح بشرائح رفع (lifter slips)، والتي تم تنظيفها أيضاً بالهواء المضغوط، ونستخدم طرف ماصة صغير لضبط شريحة الرفع في الموضع الصحيح على الشريحة.

بعد وضع شرائح الرفع، وقبل إضافة محلول التهجين المنظم، نقوم بإضافة 20 µL من 100 mM dihi, three atol إلى آبار الرطوبة الموجودة عند نهايتي الغرفة. والآن أصبحنا مستعدين لإضافة الـ cDNAs المستهدفة، والتي تم إعادة تعليقها في محلول التهجين المنظم. توضع طرف الماصة عند حافة شريحة الرفع والشريحة الزجاجية، ثم يتم سحب المحلول ببطء.

وجدنا أن استخدام التأثير الشعري لتحميل المصفوفات يوفر أعلى درجات الاتساق ويقلل بشكل كبير من دمج أي فقاعات غير مرغوب فيها. وبعد إضافة المادة المستهدفة إلى المصفوفة، يتم تجميع غرفة التهجين وتغطيتها بورق ألومنيوم. ثم تُوضع غرفة التهجين في حمام مائي هزاز للحضن طوال الليل، وعادة ما يستغرق ذلك من 14 إلى 16 ساعة.

يُضبط الحمام المائي عند 48 درجة، ويُضبط الهزاز عند 50 rpm. ومن المهم ملاحظة أن جميع الإجراءات، بدءاً من لحظة إضافة محلول التهجين ووصولاً إلى جميع عمليات الغسل التالية للتهجين، تُنفذ في إضاءة خافتة لمنع الأكسدة الضوئية. وفي اليوم التالي، تُزال الشرائح من غرفة التهجين وتُوضع في وعاء Copeland يحتوي على محلول الغسل رقم واحد، والذي تم تسخينه مسبقاً إلى 53 درجة.

تُترك الشرائح في وعاء كوبلاند لمدة دقيقة واحدة تقريباً حتى تنفصل رقائق الرفع، وعند هذه النقطة تُنزع الشرائح برفق باستخدام ملقط وتوضع في حامل شرائح مجهرية للمتابعة في عمليات الغسل. ثم تُغمر الشرائح بقوة حوالي 15 إلى 20 مرة في وعاء ثانٍ يحتوي أيضاً على محلول الغسيل رقم واحد عند درجة حرارة 53 درجة مئوية. بعد ذلك، يُغطى الوعاء بورق البرافين ويُوضع في هزاز هوائي حاضن مضبوط على درجة حرارة 53 درجة مئوية وسرعة 100 RPM.

بعد فترة الحضانة التي تستغرق 10 دقائق والغسل بمحلول الغسيل رقم 1، تُغمر الشرائح بقوة من 15 إلى 20 مرة في وعاء يحتوي على محلول الغسيل رقم 2، والذي يكون في درجة حرارة الغرفة. يتم تغطية الوعاء بفيلم البارافيلم (para film) ويوضع مرة أخرى على جهاز الهزاز في درجة حرارة الغرفة لفترة حضانة مدتها 10 دقائق. وأخيراً، تُزال الشرائح من محلول الغسيل رقم 2 وتُغمر بقوة من 15 إلى 20 مرة في وعاء يحتوي على محلول الغسيل رقم 3.

تُنقل الشرائح بعد ذلك إلى حاوية ثانية تحتوي على محلول الغسيل رقم ثلاثة المغطى بورق البرافيل، وتوضع مجدداً على جهاز الهزاز لمدة 10 دقائق. وبعد الغسلة النهائية، نقوم بإجراء عملية طرد مركزي للشرائح للتجفيف التام. وللقيام بذلك، نضع غطاء أنبوب Falcon سعة 15 mil داخل أنبوب مخروطي سعة 50 mil، ثم نضع المصفوفات داخل الأنبوب المخروطي بحيث يكون جانب الرمز الشريطي (barcode) متجهاً للأسفل.

تُوضع الأنابيب بعد ذلك في جهاز طرد مركزي برأس دوار (swinging bucket head) وتُدور بسرعة 1500 RPM في درجة حرارة الغرفة. وبعد الانتهاء من عملية الطرد المركزي، تُنقل الشرائح إلى مجموعة ثانية من الأنابيب المخروطية بسعة 50 مل، والتي تكون مغطاة بورق ألومنيوم. ثم يتم تطهير الأنابيب بغاز النيتروجين، الذي يتم ترشيحه عبر مرشح بحجم 0.22 micron، وتُغلق الأنابيب إما للنقل أو للتخزين حتى يحين وقت المسح الضوئي.

نقوم بجمع بيانات المسح باستخدام جهاز PerkinElmer scan array 5,000. يتم تقسيم صورة المصفوفة إلى شبكة، ثم تُعالج بيانات المسح الخام ويُجرى التحليل الأولي للبيانات باستخدام مجموعة برامج التصوير من شركة bio discovery. بعد ذلك، يتم تطبيع بيانات شدة إشارة البقع وإجراء التحليلات الإحصائية باستخدام BRB array tools، وهي حزمة إحصائية قوية ومتاحة مجانًا للمصفوفات الدقيقة يمكن تحميلها من المعهد الوطني للسرطان.

يتم إجراء التحليلات الإحصائية الأخرى وعمليات البحث عن أنماط التعبير الجيني باستخدام حزمة Jeep PPAs لتحليل وأنماط التعبير الجيني، وهي حزمة تحليل أخرى متاحة مجانًا عبر الويب. شكرًا لمشاهدتكم الفيديو الخاص بكيفية معالجة المصفوفات الدقيقة PT Gen two لصنوبر lob lolly.

كان الأشخاص التاليون مسؤولين عن محتوى وإنتاج هذا الفيديو التدريبي.