الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

الهدف العام من الإجراء التالي هو فصل وتقدير كمية الببتيدات في خليط معقد تعمل كبدائل للبروتينات المقابلة لها. أولاً، يتم هضم البروتينات الكبيرة داخل الخليط إلى ببتيدات مكونة باستخدام إنزيم مثل trypsin. ثم يتم إثراء الببتيدات التحليلية المستهدفة ومعيار داخلي مُضاف مُوسوم بنظير مستقر باستخدام أجسام مضادة للببتيد، مثبتة على جسيمات مغناطيسية مُشفرة ببروتين G بعد عملية الفصل.

يتم فصل الببتيدات المستهدفة من الجسيمات المغناطيسية وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة للتقدير الكمي بالنسبة للمعيار الداخلي. وتكمن المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المقايسات المناعية التقليدية في كونها أسرع وأكثر فعالية من حيث التكلفة في بناء عدد كبير من المقايسات. كما تتميز بمعدل نجاح مرتفع وقابليتها للتعدد (multiplexing) بسهولة، وهو ما سيوضحه الإجراء الذي سيتم عرضه.

يقوم فني المختبر بسحب 10 µL من بلازما الدم على ثلج رطب. يتم نقل العينة إلى لوح آبار عميقة سعة 1000 µL وتغطيتها بغشاء برافيل لمنع التبخر. لتمسخ البروتينات، يتم إضافة 20 µL من محلول urea بتركيز 9 M طازج و 30 mM من DTT إلى كل عينة، ثم تُحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. بعد ذلك، تُضاف 3 µL من iodoacetamide بتركيز 500 mM طازج إلى كل عينة وتُحضن لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. الآن، يتم تخفيف urea إلى تركيز 0.6 M باستخدام tris بتركيز 100 mM و pH 8، ثم تُضاف 10 µL من المحلول المخزون لـ trypsin بتركيز 1 µg/µL لتحقيق نسبة إنزيم إلى مادة تفاعل تبلغ 1:50.

بعد تحضين التفاعل عند 37 °C طوال الليل بإضافة 3 µL من حمض الفورميك النقي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1%، استمر في إضافة المعيار النظيري المستقر أو معايير متعددة. في حالة إجراء مقايسة متعددة، اغسل لوحة خراطيش Oasis جيداً باستخدام 500 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1% في 80% ACE nitrile مع التخلص من السائل المار. بعد ذلك، قم بموازنة لوحة الخراطيش عن طريق إضافة 500 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1% في الماء والتخلص من السائل المار.

قم بتحميل عينات الهضم على لوحة الخرطوشة واضبط تفريغ الهواء بحيث يكون التدفق بطيئاً جداً. اغسل ثلاث مرات باستخدام 500 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1% في الماء وتخلص من السائل المار، ثم استخلص الببتيدات مرتين باستخدام 500 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1% في 80% aceto trial، وبعد ذلك قم بتجفيف المستخلص عن طريق التجميد أو التبخير السريع حتى الجفاف، وأعد تكوين الببتيدات المجففة في 50 µL من PBS مضافاً إليه 0.03% Chaps. انقل العينات إلى لوحة Kingfisher قياسية ذات 96 بئراً، وأضف 1 µg من الأجسام المضادة و 1.5 µL من الخرزات المغناطيسية المطلية ببروتين G لكل هدف. قم برج الخرزات باستخدام جهاز Vortex قبل الإضافة.

لضمان تعليق الخرزات بشكل جيد، غطِّ الطبق بورق القصدير واتركه يحضن طوال الليل في جهاز طرد مركزي دوار لطيف. يتم تدوير الطبق بسرعة 400 RPM لمدة 10 ثوانٍ لإزالة أي سائل من سطح ورق القصدير.

قم بإزالة الغطاء القصديري. تتم معالجة العينة على منصة Kingfisher الآلية. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 200 µL من PBS مضاف إليه 0.03% chaps، ومرة واحدة باستخدام 200 µL من محلول PBS مضاف إليه 0.03% Chaps مخفف بنسبة 1 إلى 10. الآن، قم باستخلاص الببتيدات باستخدام 25 µL من حمض الأسيتيك بتركيز 5% مضاف إليه 0.03% chaps.

ضع لوحة الاستخلاص فوق مغناطيس وانقل السائل المستخلص إلى لوحة ذات 96 بئرًا، مع الحرص على عدم نقل الحبيبات المتبقية. غطِّ اللوحة بغطاء السد (ceiling mat)، ثم قم بتسليم هذه اللوحة التي تحتوي على السائل المستخلص إلى مطياف الكتلة الثلاثي أو الرباعي للتحليل. يتم بناء طريقة رصد التفاعلات المتعددة (MRM) من خلال الحصول على طيف كتلة ترادفي للببتيد المستهدف، ثم اختيار وتحسين أفضل أيونات الشظايا الانتقالية.

عادةً ما يستخدم إعداد تحليل MRM عمود احتجاز C 18 وأعمدة تحليلية مع طورين متحركين. يتم تحميل 10 µL من العينة واستخلاصها باستخدام تدرج خطي. ثم تُكامل مساحات القمم للببتيدات الخفيفة والثقيلة، ويُحسب نسبة مساحة القمة للببتيد غير المسمى إلى الببتيد المسمى في كل عينة.

تخرج الببتيدات الخفيفة والثقيلة في الوقت ذاته، ويمكن مراقبة انتقالات متعددة لكل ببتيد. ولتأكيد الهوية، يتم قياس مساحة ذروة الببتيد الداخلي بالنسبة لمساحة المعيار الداخلي لتوفير قياس كمي للببتيد المستهدف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ هذه التقنية في مختبرك. ويمكن استخدامها لتقدير كمية أي بروتين محل اهتمام، مما يجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات في البحوث البيولوجية.