تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

مرحباً، اسمي براد هاميلتون. أنا عالم هنا في قسم البحث والتطوير في شركة STEM Gen. سنعرض لكم اليوم إجراءً لكيفية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية باستخدام عوامل إعادة البرمجة التي يتم توصيلها عبر الفيروسات البطيئة.

يمكن استخدام هذا الإجراء لتوليد خلايا IPS ودراسة عملية إعادة البرمجة على حد سواء. تتشابه خلايا IPS مع خلايا ES من حيث المورفولوجيا والتكاثر والقدرة على التمايز إلى جميع أنواع أنسجة الجسم. وتتمتع خلايا IPS البشرية بميزة واضحة على خلايا ES، حيث تظهر الخصائص الرئيسية لخلايا ES دون المعضلة الأخلاقية المتمثلة في تدمير الجنين للحصول على هذه الخلايا.

يؤدي توليد خلايا IPS الخاصة بالمريض إلى تجاوز عقبة رئيسية أمام علاجات الطب التجديدي الشخصي، وذلك من خلال القضاء على احتمالية الرفض المناعي للخلايا المزروعة غير ذاتية المنشأ. لذا، فلنبدأ. في عدة نقاط من هذا البروتوكول، ستقوم باستبدال الوسط الغذائي لخلايا IPSC النامية أو الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات بوسط مُكيف.

يستغرق تحضير هذا الوسط ستة أيام. لذا ابدأ قبل أسبوع على الأقل من الموعد الذي ترغب فيه في بدء تجربتك. للبدء، قم بتلقيح كل بئر من بئر ستة.

طبق آبار يحتوي على 2 × 10⁵ وحدة تشكيل مستعمرة (cfu) من خلايا تغذية meth في 2 mL من وسط نمو meth. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، يتم تغيير الوسط إلى وسط زراعة خلايا human E-S-I-P-S.

يُحضن الوسط طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون. يتم جمع السائل الطافي واستبداله بوسط جديد كل 24 ساعة لمدة أربعة أيام. ثم يُرشح السائل الطافي باستخدام مرشح بمسامية 0.22 ميكرومتر.

قم بتدعيم الطافي المجمّع بـ 15 nanograms per milliliter من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي BFGF. سينتج لديك حوالي 16 milliliters من الوسط المكيف بـ meth؛ قم بتخزين الطافي المجمّع لكل يوم بشكل منفصل عند درجة حرارة 4 °C. يمكن تخزين الوسط المكيف بـ meth لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين عند درجة حرارة 4 °C أو لعدة أشهر عند درجة حرارة -20 °C.

بعد أن تأكدت من أن الوسط المكيف بالميثيل (meth conditioned medium) سيكون جاهزاً عند الحاجة إليه، دعونا نتحدث عن تحضير الخلايا. تتمثل المهمة الأولى في توليد الخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة (IPSC) في استخدام الفيروسات البطيئة (lentiviruses) لنقل أربعة عوامل نسخ مميزة للخلايا الجذعية إلى خلايا أرومة ليفية من القلفة البشرية، أو خلايا BJ. للتحضير لعملية نقل الجينات، قم بزراعة خلايا BJ بكثافة 1×10⁵ خلية لكل بئر في طبق سداسي الفجوات واتركها لتنمو.

تُحضن الخلايا في ملليلترين من وسط النمو طوال الليل عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide في اليوم ذاته. ابدأ بتجهيز أطباق الخلايا المغذية (feeder plates) بإضافة ملليلترين من 0.1% gelatin المخفف في الماء إلى طبق سداسي الفجوات، ثم تُحضن طوال الليل عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide. يغطي الـ gelatin الفجوات ويعمل كمصفوفة للخلايا.

الآن أصبحت خلايا BJ جاهزة لعملية التنقيل بالناقل العدوائي (lentiviral transduction) لتحضير الفيروس للتنقيل. أضف إلى اثنين مل من الوسط الغذائي الطازج ستة ميكروغرام/مل من polybrene وأربعة فيروسات lentiviruses، يعبر كل منها عن أحد عوامل النسخ البشرية التالية: T4 و SO2 و nanog و lin 28، بحيث يكون كل منها بنفس تعدد العدوى أو MOI.

تتضمن مجموعة الفيروسات البطيئة لعوامل إعادة البرمجة البشرية جميع هذه الفيروسات البطيئة. ولإجراء عملية التنبيغ، استبدل ببساطة وسط نمو خلايا BJ بالوسط الذي يحتوي على الفيروس. قم بهز الطبق بلطف لضمان تغطية الوسط للقاع بشكل متساوٍ.

يتم التحضين طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% carbon dioxide في اليوم نفسه. يتم إخراج أنبوبة واحدة من خلايا cf one meth feeder من النيتروجين السائل وإذابتها. يتم إزالة محلول الجيلاتين من أطباق meth feeder، والتي أصبحت الآن مغطاة بالجيلاتين في كل منها.

سنقوم بإضافة 0.2 × 10⁵ من الخلايا في 2 mL من وسط نمو meth. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% CO2. في اليوم التالي، يتم فصل خلايا BJ باستخدام 0.05% trypsin EDTA ثم تُفصل بجهاز الطرد المركزي عند 200 ×g لمدة خمس دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، يتم سحب الطافي وإعادة تعليق الخلايا في وسط النمو. قم بإزالة الوسط من طبق تغذية meth وأضف ملي لترين لكل بئر من معلق خلايا BJ. يجب أن يكون تركيز خلايا BJ حوالي 5 × 10⁴ خلية لكل بئر.

يتم التحضين طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. وبعد 24 ساعة من استزراع خلايا BJ على طبق التغذية المكون من خلايا meth، يُستبدل الوسط بوسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشري (human E-S-I-P-S). ويستمر تغيير الوسط كل 24 ساعة لمدة سبعة أيام.

في اليوم السابع، استبدل وسط زراعة خلايا ES بمليلترين من الوسط المكيف بخلايا meth. كانت خلايا meth المغذية توفر العوامل الذائبة اللازمة لنمو خلايا IPS، ولكننا نحتاج الآن إلى إضافة المزيد من هذه العوامل للحفاظ على صحة المزرعة.

يحتوي الوسط المكيف بـ Meth على جميع العوامل الذائبة التي تفرزها خلايا Meth المغذية التي تم تحضينها طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. من خلال الفحص المجهري، اختر مستعمرة خلوية، والتي تتميز بمظهر قبة صغيرة مدمجة في لوحة 24 بئراً جديدة كنت قد جهزتها مسبقاً قبل 24 ساعة بخلايا ccf one meth المغذية، ثم قم بنقل المستعمرة المختارة إلى مزرعة human E-S-I-P-S.

وسط مُدعم بـ 10 micromolar من جزيء الجذع Y 2 7 6 3 2، وهو مثبط لـ dependent kinase. يتم تغيير وسط المزرعة دون إضافة جزيء الجذع Y 2 7 6 3 2 كل 24 ساعة خلال الأيام السبعة الأولى.

بعد مرور سبعة أيام، قم بتغيير الوسط إلى وسط meth. Condition، واستمر في تمرير الخلايا حتى تظهر عليها المورفولوجيا النموذجية لخلايا ES البشرية. ابحث عن مستعمرات صغيرة ومدمجة تشبه القبة ولها حواف حادة.

يجب أن تكون المستعمرات موحدة وبنسبة عالية من النواة إلى السيتوبلازم. في هذه المرحلة، تكون قد طورت مستعمرات تمتلك مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells)، ولكن هل تعبر أيضاً عن الجينات المميزة لهذه الخلايا؟ لمعرفة ذلك، قم بصبغ المستعمرات للكشف عن علامات تعدد القدرات مثل TRA 180 وTRA 1 60 وSSEA 4 وSSEA 3 وT 4 وsox 2 وnanog وSSEA 1. للبدء، اغسل الخلايا بلطف ثلاث مرات باستخدام PBS.

بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا باستخدام 500 µL من 4% paraform, aldehyde أو أي مثبت آخر لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور 20 دقيقة، تُغسل الخلايا باستخدام PB S3 ثلاث مرات إضافية لإزالة المثبت الزائد. بعد ذلك، يتم حجب الارتباط غير النوعي عن طريق تحضين الخلايا في 500 µL من محلول الحجب (blocking buffer) لكل بئر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وبعد خطوة الحجب، يُضاف 250 µL من الجسم المضاد الأولي المُخفف بنسبة 1:100 في محلول الحجب إلى كل بئر.

سنقوم بحضن الخلايا مع الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. في اليوم التالي، تُغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط. تُحضن الخلايا مع 250 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف بنسبة 1:300 في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، مع الحفاظ عليها بعيداً عن الضوء لتجنب التبييض الضوئي بعد الحضن مع الجسم المضاد الثانوي.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وصولاً إلى الغسلة الثالثة. أضف DPI بتركيز 1 µg/mL لصب الأنوية. وأخيراً، قم بتحليل التعبير الجيني لخلايا IPS الخاصة بك.

أظهرت نتائج المورفولوجيا تحت المجهر أن خلايا الأرومة الليفية الجلدية البشرية التي تم نقل الجينات إليها باستخدام ناقلات T4 وSOX2 وNanog وLin28 قد بدأت في إظهار تغيرات مورفولوجية في وقت مبكر من اليوم الرابع بعد عملية نقل الجينات، وأصبحت تجمعات الخلايا أكثر تماسكاً في اليوم 17 من تعبير علامات تعدد القدرات. وللمزيد من التوصيف لمستعمرات خلايا IPS المعزولة، بحثنا عن وجود علامات تعدد القدرات الشائعة التي يتم التعبير عنها في خلايا ES. وأظهرت المستعمرات نشاطاً قوياً لإنزيم الفوسفاتاز القلوي.

بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء الكيمياء المناعية أو ICC على مستعمرات خلايا IPS باستخدام مجموعة من الأجسام المضادة المحددة لمؤشرات تعدد القدرات، بما في ذلك المؤشرات السطحية TA 180 1 TRA one 60 SSEA four و SS EEA three، بالإضافة إلى المؤشرات النووية T four و SOX two و Nanog. وكانت مستعمرات IPS المعزولة إيجابية لجميع المؤشرات. وتظهر نتائج ICC أن خلايا IPS أظهرت نمط تعبير مناسب لمؤشرات تعدد القدرات، مما يثبت أن خلايا IPS هذه تشبه إلى حد كبير خلايا E es البشرية غير المتمايزة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية توليد خلايا IPS عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية باستخدام جينات جذعية. مجموعة الفيروسات البطيئة لعوامل إعادة البرمجة البشرية. عند إجراء هذا الإجراء، من المهم مراعاة عدة عوامل.

أولاً، قد يلزم تعديل نسبة الفيروس النشط إلى الخلايا المستهدفة خلال خطوة ترنسدكشن (transduction) الأولية لتحقيق كفاءة ترنسدكشن قصوى. ثانياً، يمكن أن تؤثر ظروف نمو الخلايا المستهدفة على العملية؛ حيث تكون الخلايا السليمة والتكاثرية أكثر استجابة لإعادة البرمجة.

ثالثاً، عند تعديل البروتوكول لأعداد خلايا مختلفة، يوصى بتعديل أعداد الخلايا المستهدفة بشكل يتناسب مع مساحة سطح طبق الزرع. وأخيراً، ينبغي النظر في تطبيق مثبطات ROCK مثل Y 2 7 6 3 2 للمساعدة في ضمان نجاح إعادة البرمجة، حيث أظهرت الدراسات الحديثة فائدتها في تعزيز بقاء مستعمرات iPS البشرية. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.