اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

في هذا المقال المرئي، يتم إعادة برمجة الخلايا الليفية البالغة البشرية لتوليد خلايا جذعية متعددة القدرات باستخدام ناقلات فيروسية قهقرية. أولاً، يتم نقل الناقلات الفيروسية القهقرية التي تشفر عوامل النسخ T three four وSOX two وKLF four وcmic إلى الخلايا الليفية البشرية.

تُستنبت الخلايا الليفية المصابة على خلايا مغذية جنينية من الفأر لمدة تتراوح من 14 إلى 28 يوماً. ثم تُصبغ المستنبتات الناتجة باستخدام أجسام مضادة من نوع TRA 180 1 لتحديد مستعمرات الخلايا المعاد برمجهها. بعد ذلك، تُنقل المستعمرات الإيجابية إلى أطباق تحتوي على خلايا MEF لغرض التوسيع.

يؤكد التلوين الكيميائي النسيجي المناعي التعبيري عن علامات تعدد القدرات وتأسيس خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات. ويجب بعد ذلك إجراء دراسات إضافية لمزيد من توصيف هذه الخطوط. وبشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في برمجة الخلايا الجسدية وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات صعوبة بسبب تعذر تحديد مستعمرات IPSC الصحيحة.

ستقوم الدكتورة Sula Pollak، زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح هذا الإجراء. ابدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا Phoenix AM FO بكثافة تبلغ حوالي 7 إلى 8 مليون خلية لكل طبق بقطر 10 centimeter في 10 milliliters من وسط DMEM عالي الجلوكوز، ثم ضعها في الحاضنة واستزرعها طوال الليل. في اليوم التالي، قم بتحضير مخاليط عفن (transfection mixes) تتكون من 12 micrograms من ناقل يشفر إما جين T three four SOX، أو 2 klf، أو 4 cmic، أو GFP، و35 microliters من few gene six في حجم إجمالي قدره 500 microliters من وسط DMEM عالي الجلوكوز الخالي من المصل والمضاف إليه L glutamine.

قم بتحضين المخاليط لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، ولإجراء عملية عفن خلية phoenix، قم بنقل معقدات DNA برفق باستخدام الماصة إلى الأطباق التي تحتوي على خلايا phoenix، والتي يجب أن تكون في مرحلة تلاقي بنسبة 70 إلى 80%. يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية بعد مرور ست إلى ثماني ساعات.

قم بشفط الوسط واستبدله بثمانية مللي لتر من وسط DMEM عالي الجلوكوز مع المضادات الحيوية. بعد ذلك، أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة بعد عملية الحضن. استخدم ماصة لشفط وجمع الوسط المحتوي على الفيروس.

بعد ذلك، استبدل الوسط وكرر هذه العملية كل 12 ساعة حتى يتم جمع الوسط أربع مرات. احفظ الوسط عند درجة حرارة 4 °C. وبمجرد جمع كل كميات الوسط، ادمج جميع الأجزاء، ثم صبها عبر مرشح علوي للأنبوب بمسامية 0.45 µm في أنبوب مخروطي سعة 50 mL لإزالة الخلايا المنفصلة والحطام.

يمكن الاحتفاظ بالوسط المرشح، الذي يحتوي على الجسيمات الفيروسية، في الثلاجة لمدة أسبوعين دون فقدان النشاط المعدي. ولا يُنصح بالتجميد. وفي اليوم السابق لإجراء عملية نقل الجينات، يتم إذابة المخزون المجمد من الخلايا الليفية البشرية البالغة وإضافة 1×10⁵ خلية لكل بئر من أطباق الستة آبار المطلية بالجيلاتين.

في اليوم التالي، وفي أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter، اخلط 3.5 milliliters لكل من T four SOX two و klf four و cmic viral medium، وأضف poly brain بتركيز نهائي قدره six micrograms per liter كعينة ضابطة. جهّز واحد milliliter من GFP viral medium، وثلاثة milliliters من culture medium و poly brain بتركيز نهائي قدره six micrograms per milliliter. ثم اسحب الوسط من الطبق الذي يحتوي على الخلايا الليفية البشرية.

ثم أضف أربعة مليليترات من الوسط الفيروسي المختلط أو الوسط الضابط، وقم بطرد الأطباق مركزياً عند 1600 G لمدة ساعة واحدة عند 20 درجة مئوية. بعد عملية الطرد المركزي، يتم تحضين الأطباق لمدة 12 ساعة تقريباً. ثم استبدل الوسط الفيروسي بوسط زراعة الخلايا الليفية (fibroblast) وحضنها لمدة 12 ساعة أخرى.

كرر هذه العملية بدءاً من العدوى وصولاً إلى الاستزراع في وسط الخلايا الليفية، مرتين إضافيتين بعد آخر عملية عدوى. استزرع الخلايا الليفية في وسط DMEM لمدة 48 ساعة. ثم تحقق من كفاءة عدوى عمليات التحول المتوازية باستخدام وسط الفيروسات القهقرية GFP.

بعد ذلك، يتم بدء عملية إعادة البرمجة من الخلايا الجسدية إلى خلايا متعددة القدرات. تُزرع الخلايا الليفية المصابة في وسط خلايا جذعية جنينية بشرية أو وسط HES، وتُزرع الخلايا الليفية الجنينية للفئران أو MEFs بكثافة تبلغ حوالي 2 × 10⁵ خلية لكل بئر في طبق بستة آبار معالج بالجيلاتين، وذلك في وسط نمو الخلايا الليفية في اليوم التالي.

قم بتجزئة الخلايا الليفية البشرية المصابة باستخدام 0.05%tripsin EDTA وازرعها بكثافة تقريبية تبلغ 1.2 times 10 to the fourth لكل بئر في وسط نمو الخلايا الليفية. وفي اليوم التالي، استبدل الوسط بوسط HES الذي يحتوي على 0.5 millimolar من بوتيرات الصوديوم خلال الأيام السبعة الأولى من عملية إعادة البرمجة.

قم بتغيير الوسط الغذائي يومياً. استبدل الأوساط بـ HES media بدون بوتيرات الصوديوم وواصل عملية إعادة البرمجة لمدة تتراوح من سبعة إلى 21 يوماً إضافياً. يتم تغيير الوسط الغذائي يومياً في كل يوم.

افحص الخلايا المنقولة جينياً للبحث عن أي تغيرات شكلية. ستبدأ مستعمرات الخلايا في الظهور بعد حوالي 10 أيام من نقل الخلايا الليفية المنقولة جينياً إلى الخلايا المغذية. وتُسمى المستعمرات التي تحتوي على الخلايا المعاد برمجتها الآن بالخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات أو خلايا IPS البشرية.

ستكون مستعمرات خلايا IPS البشرية جاهزة للعزل خلال 14 إلى 28 يوماً بعد زراعتها على خلايا MEF المغذية. في هذه المرحلة، يمكن نقل مستعمرات خلايا IPS البشرية إما إلى أطباق تحتوي على MEF أو أطباق مغطاة بـ matrigel. يتم عرض عملية النقل إلى الأطباق التي تحتوي على MEF قبل يوم واحد من التقاط مستعمرات خلايا IPS البشرية. ازرع أطباق ذات 24 بئراً تحتوي على خلايا MEF المغذية المشععة بأشعة غاما في وسط نمو الأرومات الليفية.

تُحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5%CO2 في اليوم الذي سيتم فيه التقاط مستعمرات خلايا IPS البشرية. يتم سحب وسط نمو الخلايا الليفية من ME Fs وشطفها بمحلول PBS لإزالة أي آثار من FBS. بعد ذلك، يُضاف 0.5 milliliters من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو وسط HES الذي يحتوي على 10 micromolar من مثبط rock Y 2 7 6 3 2 إلى كل بئر، ثم يتم فحص أطباق إعادة البرمجة للتأكد من تكوين مستعمرات خلايا IPS البشرية باستخدام مجهر مثبت في غطاء تدفق صفائحي.

إذا لزم الأمر، قم بإزالة الخلايا الليفية المحيطة بمستعمرات خلايا IPS البشرية باستخدام إبرة قياس 21. اشطف الأطباق بمحلول PBS وأضف وسط HES طازجاً يحتوي على الجسم المضاد النوعي للخلايا الحية TRA 180 1. أعِد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5%CO2.

بعد مرور 30 دقيقة، استبدل الوسط بوسط HES جديد مُدعم بـ 10 micromolar من مثبط rock. ثم افحص المستعمرات باستخدام المجهر الفلوري. قم بتحديد المستعمرات الإيجابية لـ TRA من 1 إلى 81.

باستخدام علامة موضوعية وبإبرة مقاس 21 gauge، قم بتقطيع مستعمرات خلايا IPS البشرية الموجبة لـ TRA 180 1 إلى عدة قطع صغيرة. بعد ذلك، وباستخدام ماصة أوتوماتيكية، انقل شظايا مستعمرات خلايا IPS البشرية إلى آبار فردية في طبق 24 well plate يحتوي على ME Fs. تجنب نقل الخلايا غير المنتمية إلى IPS.

ضع الأطباق في الحاضنة واترك مستعمرات خلايا IPS البشرية لتلتصق لمدة تتراوح من 24 إلى 36 ساعة مع تغيير الوسط الغذائي يومياً. ستكون مستعمرات خلايا IPS البشرية ذات المورفولوجيا الشبيهة بـ HE صحيحة مرئية بعد 48 ساعة من النقل الأولي إلى طبق ذي 24 بئراً. يتم إجراء تمرير يدوي لمستعمرات خلايا IPS البشرية كل ستة إلى ثمانية أيام عن طريق تقطيعها باستخدام إبرة قياس 21. يتم توسيع المزارع في طبق ذي 12 بئراً ثم لاحقاً في طبق ذي 6 آبار بعد التوسع النسلي.

وبعد إنشاء خطوط خلايا iPS البشرية، يتم تحليل تعبير مؤشرات تعدد القدرات TRA-1-60 و SSEA-4 و T3/4 و SOX2 و nanog باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية بمجرد استقرار الخطوط الخلوية. وقد يتضمن التوصيف التفصيلي تحليلات التمايز في المختبر (in vitro) وفي الجسم الحي (in vivo)، وتحليل النمط النووي، وتحليل إسكات الجينات المنقولة، ودراسات الميثيلية، ودراسات التعبير الجيني.

يعد نقل الجينات بكفاءة باستخدام وسط يحتوي على الفيروسات القهقرية أمراً بالغ الأهمية لنجاح إعادة البرمجة ولتحديد مدى فعالية النقل الفيروسي. تم فحص الخلايا الليفية البالغة البشرية المشتقة من مريض يعاني من رنح فريدريخ بعد عدوى متتالية مرتين بوسط فيروسي قهقري يحتوي على GFP؛ وعندما تم إصابة الخلايا الليفية عن طريق الحضانة البسيطة مع الوسط الفيروسي، تم نقل الجينات في أقل من 20% من الخلايا. ومع ذلك، عندما تلت إضافة الأوساط الفيروسية القهقرية التي تحتوي على GFP [إجراء معين]، زادت كفاءة نقل الجينات بشكل كبير.

هنا تم تحويل أكثر من 80% من الخلايا لإجراء توصيف أولي لمستعمرات خلايا IPS البشرية المعزولة. تم تقييم التعبير عن علامات تعدد القدرات المميزة لخلايا ES البشرية عن طريق الكيمياء المناعية كما هو موضح هنا. كانت مستعمرات خلايا IPS البشرية المعزولة إيجابية لعلامات تعدد القدرات.

إن صبغ T three four وSOX two وnano SSEA four وTRA one 60 DNA. يظهر الصبغ المشترك مع DPI في اللوحات العلوية، حيث يتم الكشف عنه في كل من مستعمرات خلايا IPS البشرية والخلايا المغذية. وتثبت هذه النتائج أن خلايا IPS البشرية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول إعادة البرمجة هذا تعبر عن علامات تعدد القدرات المناسبة والمميزة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات غير المتمايزة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية بنجاح إلى خلايا جذعية متعددة القدرات باستخدام نقل الفيروسات القهقرية، وتحديد مستعمرات الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات الصحيحة، وإجراء التوصيف الأولي لـ HI PCs.