إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات (IPS cells) عبر التعبير المفرط بوساطة الفيروسات القهقرية لكل من OCT four و SOX 2K LF four و M مع استخدام نظام تقرير GFP. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إضافة الكمية المناسبة من كل فيروس قهقري يعبر عن GFP على حدة. بعد ذلك، تُنقل الخلايا المصابة بالفيروسات التي تعبر عن GFP إلى أطباق مطلية بـ 0.1% gelatin تحتوي على أرومات ليفية جنينية للفئران.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في استبدال الوسط الغذائي بوسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. وأخيراً، يتم عزل مستعمرات الـ IPS التي تم إسكات الـ GFP فيها والتي تظهر مورفولوجيا مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية. وفي النهاية، تظهر النتائج تعبير مؤشرات تعدد القدرات الداخلية من خلال التلوين المناعي الفلوري و R-T-Q-P-C-R.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل صبغ نمط الحياة باستخدام علامة سطحية متعددة القدرات ومراقبة التغيير المورفولوجي، في الحصول على نتائج مرغوبة. يمكن عزل مستعمرات الخلايا بسهولة باستخدام فقدان تعبير GFP كعلامة للخلايا متعددة القدرات لبدء الزراعة. يتم تحضير الخلايا الليفية البشرية في وسط الخلايا الليفية قبل يوم واحد من العدوى؛ حيث يتم استزراع 1×10⁵ من الخلايا الليفية البشرية في بئر واحدة من طبق سداسي الآبار. وفي اليوم التالي، يتم سحب الوسط لإزالة الخلايا الميتة وإضافة 2 mL من وسط الخلايا الليفية الطازج الذي يحتوي على 5 µg/mL من كبريتات البروتامين.

بعد ذلك، أضف بعناية الكمية المناسبة من كل فيروس يعبر عن GFP بما يتوافق مع تعدد عدوى قدره 5. قم بحضن الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال الليل بعد يوم واحد من العدوى. قم بإزالة الطافي الفيروسي واغسل ثلاث مرات باستخدام 2 milliliters من PBS.

بعد ذلك، أضف 2 mL من وسط نمو الخلايا الليفية (fibroblast medium) بعد ثلاثة أيام من العدوى. تحقق من فلورة GFP وأضف 2 mL من وسط نمو الخلايا الليفية إلى البئر في اليوم التالي. ازرع 1×10⁴ لكل سنتيمتر مربع من الخلايا الليفية الجنينية للفأر المشع (irradiated mouse embryonic fibroblast) أو خلايا التغذية (feeder cells) في وسط نمو الخلايا الليفية داخل طبق بتري بقطر 10 cm ومطلي بـ 0.1% Gelatin.

حضن الخلايا عند 37 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بفصل الخلايا الليفية البشرية المصابة باستخدام 1 mL من 0.05% tripsin EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 °C، ثم قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 G. أعد تعليق الخلايا في 10 mL من الوسط الخاص بالخلايا الليفية وأعد زرع الخلايا على أطباق مطلية مسبقاً بـ 0.1% gelatin مع mfs. بعد 24 ساعة.

استبدل الوسط بوسط استزراع HESC وقم بتغيير الوسط يومياً. ستبدأ مستعمرات شبيهة بـ ESC في الظهور بعد 20 إلى 27 يوماً من العدوى، وذلك بعد ظهور مستعمرات شبيهة بـ ESC تحت المجهر الفلوري. تحقق من عدم وجود فلورة GFP في مستعمرة تظهر شكلاً مورفولوجياً مشابهاً لـ HSCs.

باستخدام ماصة سعة 10 µL، يتم التقاط مستعمرات IPSC فردية ووضعها في بئر واحد من طبق يحتوي على 12 بئراً مغطى بالجيلاتين والميث، ومُدعم بوسط HESC. يتم تغيير الوسط يومياً، ثم تُنقل الخلايا عن طريق غسل الطبق بـ 1 mL من DMM F 12.

ثم أضف 0.5 milliliter من collagenase واحضن الخليط لمدة 10 minutes عند 37 °C. اغسل الخلايا مرتين باستخدام DM A MF 12. بعد ذلك، أضف two milliliters من وسط HESC الطازج.

بعد ذلك، استخدم رافع الخلايا لتفتيت المستعمرات إلى قطع صغيرة وفصل الخلايا المتبقية من الطبق. انقل قطع المستعمرات المعاد تعليقها إلى بئر واحد من طبق سداسي الآبار مغلف بالجيلاتين وخلايا MEF، ثم قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.

لفحص الخلايا عن طريق التألق المناعي، اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ثم قم بتثبيتها باستخدام 4%paraldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بنفاذيتها باستخدام 0.2%tritton X 100 في PBS لمدة 30 دقيقة.

قم بحجب الارتباط غير النوعي عن طريق تحضين الخلايا بـ 3%BSA في PBS لمدة ساعتين. بعد ذلك، حضّن الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وحضّنها مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS خلال الغسلة الأخيرة. أضف dappy ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بتصوير الخلايا باستخدام مجهر فلوري للتحليل الكمي في الوقت الفعلي.

قم بعزل الحمض النووي الريبوزي (total RNA) باستخدام تقنية PCR من الخلايا السلفية القلبية البشرية (IPCs) المشتقة من الخلايا الليفية البشرية، وذلك باستعمال طقم عزل RNA. ثم قم بتخليق الشريط الأول من الحمض النووي المتمم (cDNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي.

ثم استخدمه كقالب لـ QPCR للكشف عن جينات تعدد القدرات. تظهر هنا التغيرات المورفولوجية الملحوظة أثناء إعادة البرمجة من اليوم الخامس إلى اليوم 10 و14 و21 للخلايا الليفية البشرية من نوع BJ التي تم إصباتها بمزيج من الفيروسات القهقرية الحاملة لـ OCT4 وSOX2 وKLF4 وc-Myc، حيث تبدأ الخلايا في إظهار مورفولوجيا شبيهة بـ HESC بعد 21 يوماً، ويتم التعرف على IPCs من خلال فلورة GFP.

تعبر الخلايا الجذعية متعددة القدرات، مثل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة وافرة القدرة (IPCs)، عن الآلية الجزيئية اللازمة لتثبيط تعبير الجينات الفيروسية المندمجة. ومع ذلك، فإن النواقل الفيروسية القهقرية المستخدمة هنا تعبر عن GFP جنباً إلى جنب مع جينات إعادة البرمجة بواسطة منطقة LTR الفيروسية القهقرية. وبالتالي، تُعتبر الخلايا التي تعبر عن GFP بشكل مستمر أنها تعبر عن الجينات المنقولة دون حدوث إسكات للجينات الفيروسية المندمجة؛ كما يظهر هنا بوضوح، تظهر مستعمرات IPSC التي تمت إعادة برمجتها واكتسبت الشبكة الجزيئية لتعدد القدرات غياب تعبير GFP.

يوضح هذا الشكل تحليل الكيمياء النسيجية المناعية للمستعمرات المشتقة من الخلايا الليفية Detroit 5 51 باستخدام أجسام مضادة لـ TRA 180 1 و TRA one 60 و SSEA four و T four و nano كما هو موضح بنجاح. تعبر الخلايا السلفية المستحثة (IPCs) التي تمت إعادة برمجتها عن جميع هذه العلامات. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative R-T-P-C-R) لتحليل التعبير الجيني، وأظهر أن T four و SOX two و KLF four M و nano قد زادت بشكل ملحوظ مقارنة بالخلايا الليفية الأصلية، ولكنها كانت متناسبة مع تلك الموجودة في H nine HSCs.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إحداث العدوى بالفيروس، وتحديد والتقاط خلايا IPA المبرمجة بالكامل باستخدام المجهر الفلوري.