التناضحي في تجنب انواع معينة ايليجانس : وظيفة متشابك من اثنين من الجينات ، Orthologues لحقوق الإنسان NRXN1 و NLGN1 ، كمرشحين للتوحد

مرحباً، اسمي مانويل رويز روبيو من قسم الوراثة في جامعة قرطبة بإسبانيا. نحن نستخدم C. elegans كأداة تجريبية في دراسة التوحد، مستفيدين من الجهاز العصبي الموصوف بدقة في C. elegans. نقوم بدراسة طفرات في الديدان الخيطية، والتي تظهر خللاً في الجينات المشاركة في التشابك العصبي والمرتبطة بالتوحد.

النيوريكسينات والنيوروليجينات هي جزيئات التصاق غشائية موجودة في المشابك العصبية. يحتوي رأس C. elegans على الأمفيد، وهو عضو حسي في الديدان الخيطية يتوسط الاستجابة للمؤثرات المختلفة، بما في ذلك القوة الاسموزية. يتكون الأمفيد من 12 عصبوناً حسياً ثنائي القطب بزائد شجيرية مهدبة ومحوار طرفي قبل مشبكي واحد.

يُعد اثنان من هذه العصبونات، وهما ASHR وASHL، مهمين بشكل خاص في الوظيفة الحسية التناضحية، حيث يقومان بالكشف عن المواد المنفرة القابلة للذوبان في الماء ذات القوة التناضحية العالية. سنعرض طريقة حلقة الفركتوز 4M لقياس التجنب التناضحي في طفرات C. elegans التي تعاني من خلل في المشابك العصبية.

لتقييم آثار neurexin و neuroligin في تجنب القوة الاسموزية العالية، قمنا برصد الاستجابة المختلفة لسلالات C. elegans الطافرة التي تعاني من خلل في جينات nrx-1 و nlg-1، وذلك باستخدام طريقة تعتمد على حلقة من محلول الفركتوز بتركيز 4M. في يوم التجربة، يتم تحضير محلول مخزون من الفركتوز بتركيز 4M مع 1% من Congo red، ويُذاب تماماً في درجة حرارة الغرفة. ثم تُرسم حلقة بقطر واحد سنتيمتر على طبق NGM في مركز الوسط الصلب.

باستخدام 15 µL من محلول الفركتوز الأحمر بتركيز 4M. يُترك الفركتوز ليتغلغل في الآجار لمدة خمس دقائق تقريباً، ويجب إجراء التجربة بطريقة التعمية. يتم وضع علامات على الطبق الذي يحتوي على كل سلالة سيتم اختبارها بواسطة باحث ثانٍ.

يتم إجراء تحليل التجنب (SA) باستخدام هذه العلامات غير المطلوبة. عندما تنتهي التجربة قبل حوالي 24 ساعة من تنفيذ عملية البيع، من الضروري اختيار أربع يرقات في المرحلة L4 من كل نمط جيني ونقلها إلى طبق AFL NGM يحتوي على بكتيريا e coli والحفاظ عليها عند درجة حرارة 20 °C في اليوم التالي. يجب أن تبدأ التجربة باستخدام البالغين اليافعين.

ضع دودة واحدة من كل سلالة داخل دائرة الراحة وتابع كل حيوان لتوقيت استجابته لحاجز التحفيز. يجب إجراء التجربة على 10 حيوانات من كل سلالة، مع تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل للحصول على نتيجة حاسمة. تُصنف الديدان التي تتجنب الحلقة الحمراء ست مرات متتالية على أنها طبيعية.

تُعتبر الحيوانات التي تخرج من الحلقة في أقل من ست محاولات معيبة في التحكم بحساسية التناضح، ويجب استخدام سلالة ضابطة في كل تجربة، ويُستخدم حيوانان كضوابط إيجابية لأنها تتجنب حاجز الحلقة. تستجيب السلالات الضابطة بالتحرك للخلف عندما تجد حاجزاً تناضحياً يتكون من فركتوز 4M. تظهر الطفرات الناقصة في النيوركسين سلوكاً مشابهاً لهذا فيما يتعلق بقوة التناضح.

ومع ذلك، فشلت الطفرات التي تعاني من نقص في NEUR في الكشف عن هذا الحاجز الأسموزي. واستعادت الطفرات المزدوجة في أليلات neur و nout النشطة المختلفة النمط الظاهري للنوع البري المستجيب للقوة الأسموزية. وللحصول على ديدان مثبطة عن طريق التغذية بتداخل RNA، يتم عزل مستعمرات من سلالة e coli HD 115 التي تم تحويلها بنواقل L 44 40 التي تحتوي على قطعة مقابلة للجين المستهدف. يتم عزل البكتيريا على أطباق LBA أو أطباق تحتوي على الكربون في اليوم التالي.

اختر مستعمرة من البكتيريا وقم بتلقيحها في وسط سائل LV. استمر في تحضينها لمدة سبع ساعات تقريباً مع الرج عند 37 درجة. ضع قطرة من هذه المزرعة على طبق NGM يحتوي على carbonic ceiling وIPTG، واتركها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح للبكتيريا بالنمو وبدء تحريض التعبير عن قطعة الجين المستهدف.

من الضروري استخدام ضابط موجب وضابط غير سالب للتداخل الحمضي النووي الريبوزي (RNA interference). تجارب التغذية. الضابط السالب يكون متماثلاً.

سلالة HT 115 محولة باستخدام ناقل TL 44 40. الضوابط الإيجابية هي خلايا ELI HT 115 محولة بناقل L 44 40 الذي يحتوي على تسلسل جين 22. يؤدي تعطيل هذا الجين إلى ظهور نمط ظاهري مهتز يمكن تمييزه بسهولة تحت المجهر التشريحي.

اليوم الأول. يتم نقل أربعة من الديدان في المرحلة L4 من أطباق NGM PLA التي تحتوي على بكتيريا إلى طبق يحتوي على بكتيريا وتُحضن عند 20 °C لمدة 12 ساعة. تمثل هذه الفترة فترة صيام.

في اليوم التالي، انقل البالغين الشباب السريعين إلى طبق ملقح ببكتيريا تعبر عن الجين المستهدف بتداخل RNA محدد. اتركها لمدة 48 ساعة تقريباً عند 20 درجة مئوية للحصول على نسل F1. بعد ذلك، انقل عدداً قليلاً من بالغين F1 إلى طبق آخر ملقح بنفس البكتيريا على مدار اليومين التاليين.

قم باختيار وعزل البالغين اليافعين من نسل الجيل الثاني (F2). يتم تقييم الأنماط الظاهرية لسلالة Bristol N2 البرية التي تتغذى على بكتيريا OP50. كانت ناقلات L4 40 تتحرك للخلف عند مواجهة الحاجز الاسموزي.

فشلت سلالة Bristol And true white النوعية التي غُذيت ببكتيريا تعبر عن قطعة من جين nrx-1 من دودة C. elegans في اكتشاف محاليل الفركتوز بتركيز 4M. ومع ذلك، استعاد الطافر الناقص لجين nrx-1، والذي كان غير قادر على اكتشاف الحاجز الاسموزي، هذه القدرة عندما غُذيت ببكتيريا تعبر عن قطعة من جين nrx-1 من دودة C. elegans. في هذا الفيديو، نعرض طريقة بسيطة تسمح بدراسة تأثير الجينات التي تؤثر على استجابة تجنب الضغط الاسموزي في دودة C. elegans.

تُستخدم حلقة من الفركتوز المركز مع صبغة الكونغو الحمراء (Congo Red) لتحليل استجابة الديدان للقوة الأسموزية. تعاني الطفرات الناقصة في neuroligin من خلل في هذه الاستجابة، ومع ذلك، فإن طفرات NU لا تعاني من ضعف في اكتشاف الإجهاد الأسموزي، حيث تظهر استجابة مماثلة للسلالة البرية. يوضح هذا الفيديو أن سلالات الطفرات المزدوجة التي تحمل أليلات تعطيل (knockout) مختلفة في جينات ing و releasing قد استعادت النمط الظاهري للسلالة البرية في الاستجابة للقوة الأسموزية.

تم تأكيد هذه الملاحظات باستخدام تداخل RNA، عبر منهجية التغذية الموجهة. وبهذه الطريقة، تضررت سلالة النوع البري في التعرف على الحاجز الاسموزي عندما غُذيت ببكتيريا تعبر عن التسلسل المقابل لجين ING. ومن ناحية أخرى، استعاد الطفرات المعيبة في neur، والتي تكون غير قادرة على اكتشاف محلول الفركتوز 4M، هذا السلوك عندما غُذيت ببكتيريا تعبر عن التسلسل المقابل لجين NNU.

تشير النتائج الموضحة في هذه التجربة إلى أن n seeing و neur قد يكونان مشاركين في الاتصال التشابكي للخلايا العصبية الحسية في الدودة الخيطية، وكذلك أنهما يتفاعلان مع بعضهما البعض بطريقة تؤثر على الوظيفة التشابكية. حسنًا، وداعًا وبالتوفيق في تجاربكم.