نماذج لتوصيف الدوائية من المسوخ جيم ايليجانس نقل متشابك

أهلاً بكم، أنا كودي لوك من مختبر كالدول في قسم العلوم البيولوجية بجامعة ألاباما. أنا كايل لي وسأوضح لكم كيفية تحضير الديدان لاختبارات التعرض لـ outta carb وPTZ. أنا برنارد تو وسأقوم بعرض كيفية إجراء اختبارات out carb.

أنا كايلين بيري، والمسؤولة عن فيديوهات C. elegans. سأقوم في هذا العرض بتقديم الشرح التطبيقي لمقايسة التعرض لـ PTZ. سأوضح اليوم، بالتعاون مع زملائي، كيفية توصيف طفرات النقل المشبكي باستخدام نموذج C. elegans للصرع بعد التعرض لـ PTZ و Aldicarb، وذلك عبر سلسلة من السلالات الطافرة التمثيلية.

لنبدأ الآن. سيبدأ كايل لي اليوم بشرح كيفية تحضير مقاييس ALD carb في اليوم الأول من الإجراء. تأكد من توفر 30 دودة على الأقل في مرحلة البلوغ المبكر من كل نمط جيني ومن كل مكرر لإجراء مقاييس ALD carb في اليوم الثاني.

يُفضل أن يختار الباحث 50 دودة أو أكثر في المرحلة الرابعة من اليرقات (L4) ونقلها إلى أطباق NGM جديدة خالية من مبيدات الفطريات ومزروعة ببكتيريا e coli OP 50 كمصدر للغذاء. تُترك الديدان لتنمو لمدة تتراوح بين 12 و24 ساعة في درجة حرارة ثابتة ومسموح بها؛ وتعد درجة الحرارة بين 20 degrees Celsius و22 degrees Celsius هي الأفضل، وإن كانت درجة حرارة 25 degrees Celsius مقبولة أيضاً.

في اليوم الثاني، قم بتحضير محلول مخزون بتركيز 100 millimolar من Al Decarb و70%ethanol، ثم وزع الكمية المناسبة من Al Decarb على أطباق NGM. نحن نستخدم بانتظام تركيز 0.5 millimolar من al Decarb عن طريق صب 37.5 microliters من Al Decarb بتركيز 100 millimolar في أطباق Petri غير مهواة مقاس 60 millimeter تحتوي على 7.5 milliliters من in gm. اترك أطباق alde carb لتجف لمدة تتراوح تقريباً بين 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ليس من الضروري فتح الأغطية بعد جفاف الأطباق. أضف أحجاماً متسقة من e coli في مركز كل طبق alde carb واتركها لتجف لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 دقيقة إضافية. في درجة حرارة الغرفة، نقوم عادةً بإضافة 25 µL من e coli OP 50.

يؤدي هذا الحجم من سلالة OP 50 إلى تكوين مساحة كافية من الغذاء (food lawn) للحفاظ على الديدان في بقعة صغيرة بمركز الطبق دون حدوث تكدس. وبمجرد جفاف مساحة الغذاء، ابدأ في إجراء مقايسات alba carb. ونظراً للطبيعة التقديرية لمقايسات ALD carb، يوصى بشدة بإجراء التجارب بطريقة التعمية (blindly).

للقيام بذلك، يقوم زميل الباحث الرئيسي بإعادة تسمية الأطباق الأصلية التي تحتوي على الديدان المراد فحصها، أو يمكن للزميل نقل الديدان من الأطباق الأصلية إلى أطباق cipher alde carb مباشرة قبل بدء المؤقت. والآن بعد أن تم تجهيز الأطباق، سيبدأ ABO في التحليل؛ وللبدء في التحليل، يتم حساب عدد الديدان المشلولة.

هناك نهجان رئيسيان لتحديد الشلل الناجم عن إزالة الكربوكسيل الحادة. يحدد النهج الأول الشلل من خلال توقف الضخ البلعومي. في هذه الملحوظة المرئية، يظهر هيكل داكن يقع ضمن تجويف بلعوم الدودة على يمين الشاشة.

يُسمى هذا التركيب بالطاحونة، وهو ينقبض بشكل إيقاعي عبر آلية كولينيرجية. لقد تباطأت حركة الدودة في هذا الفيديو بشكل كبير نتيجة التعرض لـ Al Decarb، ومع ذلك، لا تزال الطاحونة البلعومية لهذه الدودة تتحرك بوضوح.

وبناءً على ذلك، لا يتم اعتبار هذه الدودة مشلولة بناءً على تعريف توقف الضخ. يجب أن يلاحظ المشاهد في هذا الفيديو أن الطاحنة البلعومية الموجودة على يمين الشاشة لا تنقبض، مع اعتبار توقف الضخ هو التعريف الإجرائي للشلل الناجم عن Decarb. لذا، يجب تصنيف هذه الدودة على أنها مشلولة.

ومع ذلك، ومثل الدودة في الفيديو السابق، تُظهر هذه الدودة حركات بحث عن الطعام طفيفة من جانب إلى آخر. وبالرغم من تضرر قدرتها على الحركة بسبب Al Decarb، فإن هذه الحركات ستمنع المجرب من اعتبار هذه الدودة مشلولة وفقاً للمنهج الثاني في تعريف الشلل الناجم عن Al Decarb، وهو عدم القدرة الكاملة على الحركة وعدم الاستجابة للمس. ويتضمن المنهج الثاني لتعريف الشلل الناجم عن Al Decarb وخز كل دودة باستمرار باستخدام سلك بلاتيني والتحقق من وجود استجابة.

إذا لم يكن من الممكن اكتشاف حركات الجسم بالعين المجردरे، فإن نهجنا المفضل هو وخز الديدان مرتين في الرأس ومرتين في الذيل كل 30 دقيقة لمدة ثلاث ساعات إجمالاً. كما ستلاحظون، فإن الدودة في هذا الفيديو لا تحرك جسمها بشكل واضح. ومع ذلك، نظرًا لأن هذه الدودة تستجيب للوخز بتحريك ذيلها بوضوح، فإننا لا نصنف هذه الدودة على أنها مصابة بالشلل.

وفقاً للتعريف الثاني للشلل الناجم عن إزالة الكربوكسيل (decarb). ومثل الدودة في الفيديو السابق، لا تقوم هذه الدودة بتحريك جسمها بشكل واضح، وبالتالي تتطلب إجراء اختبار الوخز. ومع ذلك، وعلى عكس الدودة في الفيديو السابق، لا تستجيب هذه الدودة بوضوح للوخز.

بناءً على ذلك، تصاب هذه الدودة بالشلل وفقاً للتعريف الثاني للشلل الناجم عن Al Decarb. وعلى الرغم من أن الفرق بين الحالة المشلولة وغير المشلولة بفعل Al Decarb قد يكون طفيفاً، إلا أنه يجب أن يكون الباحثون قادرين على تحديد التغيرات الجوهرية في النقل المشبكي ببساطة من خلال ملاحظة أعداد كبيرة من الديدان الممثلة التي تعرضت لـ Al Decarb فور نقلها إلى أطباق Al Decarb. بينما تظل الديدان من النوع البري (Wild type) قادرة على الحركة.

في هذا الفيديو، سيتم عرض نفس الديدان من النوع البري التي ظهرت في الفيديو السابق بعد ساعة واحدة من التعرض لـ Al Decarb. نلاحظ أن سرعة حركة الديدان قد انخفضت إلى حد ما، ولكنها لا تزال تتحرك بوضوح.

خلافاً للديدان من النوع البري، فإن طفرات tomasin one في هذا الفيديو إما أن تكون مشلولة تماماً أو تكاد لا تتحرك بعد ساعة واحدة من التعرض. وتتسق هذه النتيجة مع كون طفرات tomasin one تعاني من إفراز مفرط للأسيتيل كولين بسبب عدم القدرة على التنظيم السلبي لإطلاق الناقل العصبي عند الوصلات العصبية العضلية؛ حيث يؤدي فائض الأسيتيل كولين في الشقوق التشابكية عند الوصلات العصبية العضلية، مقترناً بتثبيط تحلل الأسيتيل كولين بواسطة Bial Decarb، إلى جعل طفرات tomasin one مفرطة الحساسية. وعلى الرغم من عدم عرض ذلك هنا، فقد افترض أن نتائج مماثلة تنجم عن اختبارات alde carb مع أليلات فقدان الوظيفة لـ on 43، الذي يشفر نظير ortholog في C elegance لبروتين calcium cal Moulin dependent protein kinase two. ويظهر هذا الفيديو طفرات on 25، والتي تعاني من نقص في الانتقال التثبيطي الـ GABAergic.

بعد ساعة واحدة من التعرض لـ alde carb، وبشكل مشابه لطفرات tomasin one و M 43، تُظهر هذه الطفرات ضعفاً ملحوظاً في القدرة الحركية ناتجاً عن التعرض لـ alde carb، ويبدو أنها أكثر تأثراً من الديدان البرية (wild type) عند التعرض لـ al Decarb لنفس المدة الزمنية. وتتسق هذه النتيجة مع كون طفرات M 25 تعاني من تحفيز مفرط لعضلات جدار الجسم نتيجة الجمع بين التعرض لـ al Decarb وانخفاض النقل GABAergic، مما يؤدي إلى زيادة نسبة النقل الاستثاري إلى التثبيطي عند الوصلات العصبية العضلية في CL ELs وما يلي ذلك من شلل. ومع ذلك، فإن طفرات tomasin one on 43 و on 25 تظهر حساسيات مماثلة تجاه Al Decarb في هذه النقطة الزمنية.

على الرغم من تباين أسباب التحفيز المفرط لعضلات جدار الجسم، لا يمكن للمجرب معرفة الآلية الكامنة وراء فرط الحساسية دون معرفة هويات الطفرات المسببة أولاً. في هذا الفيديو، عدنا إلى نفس الديدان من النوع البري (wild type) التي ظهرت في فيديو سابق بعد ثلاث ساعات من التعرض لـ al Decarb في هذه النقطة النهائية من مقايسة ALD carb الخاصة بنا؛ حيث يجب أن يظهر بوضوح أن هذه الديدان، رغم كونها من النوع البري، إما مشلولة تماماً أو تتحرك بصعوبة بالغة. أصبحت هذه الديدان الآن مشابهة ظاهرياً لطفرات TOM one و M 25 التي ظهرت بعد ساعة واحدة من التعرض لـ alde carb، ويفترض أن ذلك يعود إلى وصول انتقال الناقل العصبي الكوليني الاستثاري إلى مستويات مماثلة، وبخلاف الديدان من النوع البري، تظل طفرات Synap Bren one متحركة بشكل ملحوظ بعد ثلاث ساعات من التعرض لـ alde carb.

تتوافق هذه النتيجة مع طفرات Synaptive Bren one، التي تفتقر إلى المستويات الطبيعية من إفراز النواقل العصبية، حيث تظهر تحفيزاً كولينرجياً أقل في عضلات جدار الجسم مقارنة بديدان النوع البري بعد التعرض لمستويات متطابقة من alde carb في هذا الوقت. ومن المتوقع أن تظهر طفرات Point on four، التي تعاني من نقص محدد في النقل الكولينرجي، حساسية مماثلة تجاه Al Decarb مثل طفرات Synaptive Bren one. وعلى العكس من ذلك، تظل طفرات Tomasin one و O 25 مفرطة الحساسية مصابة بالشلل، على عكس ديدان النوع البري.

ومن الجدير بالذكر أن بعض الديدان، وخاصة تلك المقاومة لمادة Al Decarb، قد تحاول الزحف خارج الطبق. وفي هذه الحالة، يمكن للباحث توزيع كمية ثابتة من حمض البالميتيك، والذي يعمل كحاجز مادي يمنع حركة الديدان. لقد قمنا بتوزيع 25 µL من حمض البالميتيك بتركيز 10 mg/mL في الإيثانول حول أطباق Al Decarb.

بهذا يكتمل نموذج التعريض لـ Al Decarb. والآن، سأقوم بشرح نموذج التعريض لـ Penta Lean Terazol. ستساعدنا Kaylin Berry في إجراء اختبارات PTZ.

تعد عملية تحضير الديدان لاختبارات PTZ مشابهة أساساً لعملية تحضير الديدان لاختبارات alde carb. وتتمثل الاختلافات الجوهرية الوحيدة بين هذين الاختبارين فيما يلي: حيث نستخدم DDH two O كمذيب لـ PTZ بدلاً من الإيثانول بتركيز 70%.

وأيضاً، نظراً لأننا نقوم بتوزيع أحجام أكبر من PTZ مقارنة بـ ALDE carb بشكل متكرر، فإننا نترك الأطباق لتجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إضافة OP 50. ويمكن أيضاً استخدام حمض البالمتيك مع PTZ. ومن المهم أيضاً ملاحظة أن PTZ أقل استقراراً بكثير من alde carb ويجب تخزينه عند درجة حرارة -20 °C.

لبدء التحليل، قم بعدد الديدان التي تعاني من تشنجات ضوئية صرعية كل 30 دقيقة لمدة ساعة كاملة. ومن الأفضل تسجيل أعداد الديدان التي تظهر أنواعاً مختلفة من التشنجات في فئات منفصلة، مثل تشنجات الجسم بالكامل، والتشنجات الأمامية التي نسميها "head Bobs"، ومزيج من التشنجات الأمامية مع شلل عضلات جدار الجسم والتي نسميها "tonic-clonic"، أو شلل الجسم بالكامل والذي نسميه "tonic tonic". وغالباً ما يتبع النشاط الشبيه بالنوبات، كما هو ظاهر في الدودة على اليمين، التشنجات من نوع "tonic-clonic" كما هو ظاهر في الدودة على اليسار "tonic".

قد ينتج النشاط الشبيه بالنوبات ببساطة عن تعب العضلات الذي يلي التشنجات التوترية الرمعية المتكررة. ومع ذلك، تشير بياناتنا غير المنشورة إلى أن بعض الديدان يمكن أن تصبح في حالة توترية عند التعرض لـ PTZ بطريقة مشابهة للشلل الناجم عن الـ al decarb دون أن تكون قد عانت من تشنجات توترية رمعية مسبقاً. نعرض هنا دودة طافرة تمثيلية في النقل التشابكي وهي تزحف في غياب PTZ، وهو مضاد لمستقبلات GABA ومحفز شائع للنوبات في نماذج حيوانية مختلفة من النوبات والصرع.

لاحظ أن طرف أو مقدمة الدودة تتأرجح من جانب إلى آخر أثناء البحث عن الطعام. في هذا الفيديو، نعرض دودة أخرى من سلالة طفرة النقل التشابكي نفسها المستخدمة في الفيديو السابق. لاحظ أن هذه الدودة، الموجودة في وسط يحتوي على 2.5 milligrams PTZ لكل milliliter من الماء، تستمر في الغالب في تحريك رأسها من جانب إلى آخر أثناء البحث عن الطعام.

ومع ذلك، تتوقف هذه الدودة أحياناً عن البحث عن الطعام من جانب إلى آخر وبدلاً من ذلك تدفع جزأها الأمامي للأمام بشكل متكرر. وأخيراً، ينبغي ملاحظة دودة تحمل الطفرة نفسها التي تحملها الديدان في الفيديوهين السابقين في وجود 10 milligrams PTZ لكل milliliter من الماء. لاحظ أن هذه الدودة لديها انخفاض في البحث عن الطعام من جانب إلى آخر، وهي تدفع جزأها الأمامي للأمام بتردد وكثافة أكبر مما كانت عليه مع التركيز المنخفض من PTZ.

تُظهر هذه النتائج اعتمادية جرعة PTZ، وهو ما نلاحظه في جميع طفرات النقل التشابكي الحساسة لـ PTZ. ومن المهم الإشارة إلى أن التعرض لـ PTZ ليس كافياً لتحفيز تشنجات شبيهة بالصرع في الديدان من النوع البري. وبالمثل، فقد حاولنا ولكننا لم نلاحظ تشنجات شبيهة بالصرع ناتجة عن PTZ في الديدان التي تعاني من قصور محدد في النقل الكوليني مثل on four أو الديدان التي لديها نقل كوليني مفرط مثل tomasin one.

وبناءً على ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن التمييز بشكل أكبر بين طفرات النقل التشابكي ذات المقاومة لـ alde carb، سواء كانت تعاني من قصور في الوظيفة التشابكية العامة أو قصور محدد في النقل الكوليني، وذلك استناداً إلى حساسيتها النسبية لـ PTZ. ولعل من المثير للدهشة أن طفرة ONC 25 ذات القصور الوظيفي الشديد، والتي تفتقر إلى التعبير القابل للكشف عن GABA في الخلايا العصبية الحركية المثبطة في *C. elegans*، لا تظهر تشنجات صرعية تلقائية كما هو موضح في هذا الفيديو.

طفرة ONC 25 عند تعريضها لـ 10 milligrams من PTZ لكل milliliter من الماء؛ ومع ذلك، تظهر تشنجات توترية رمعية قوية، على الرغم من أن التشنجات الأمامية فقط مع بعض الحركات سبقت التشنجات التوترية الرمعية المرتبطة بـ ONC 25، والتي لم تظهر في العرض، وحاكت تشنجات طفرات synap Bren one. لذلك، لا ينبغي للباحث أن يفترض أن جميع طفرات GABA المثبطة ستظهر تشنجات توترية رمعية أو نشاطاً شبيهاً بالنوبات التوترية المرتبطة بها وثيقاً في وجود PTZ، خاصة عند الأخذ في الاعتبار احتمالية الحصول على أليلات طافرة ناقصة التعبير (hypomorphic mutant alleles).

بعد أن أثبتنا وجود فرط حساسية تجاه alde carb وPTZ في طفرات GABA المثبطة، ولكن فرط حساسية تجاه alde carb فقط وحساسية طبيعية تجاه PTZ في الطفرات التي تفتقر إلى التنظيم السلبي للنقل الكوليني، قد يتساءل المرء عن مظهر طفرات فقدان الوظيفة في UNC 43 عند تعرضها لـ PTZ، نظرًا لأنها تعاني أيضًا من فرط حساسية تجاه Alda carb مثل طفرات النقل التشابكي الأخرى لدينا. لا تظهر طفرات 43 تشنجات واضحة تشبه الصرع في غياب PTZ، رغم أن هذه الطفرات تعاني من انقباضات نادرة غير متكررة، ولكنها تظل تلقائية في كامل الجسم؛ ومع ذلك، بعد التعرض لـ 10 milligrams PTZ per milliliter من الماء، تظهر طفرات فقدان الوظيفة في 43 تشنجات قوية ومتكررة في كامل الجسم وتعتمد على الجرعة. في الوقت الحالي، تبدو هذه النتائج غامضة ولكنها تشير إلى أن UNC 43 يجب ألا يكون له دور محدد في النقل GABAergic المثبط أو دور في التنظيم السلبي فقط لإطلاق الناقل العصبي.

في الجهاز العصبي لـ C elegance، لقد أوضحنا لكم للتو كيفية توصيف طفرات النقل التشابكي CL elgan باستخدام محفزات عصبية متكاملة، وهي alde carb، وهو مثبط لإنزيم كولين استريز، و PTZA، وهو مضاد لمستقبلات GABA. عند اتباع أي من النماذج الفارماكولوجية المتكاملة، تذكر أن درجة الحساسية لمحفز عصبي واحد لا يمكن أن تتنبأ بدرجة الحساسية للمحفز العصبي الآخر. يجب أن يساعد استخدام فحوصات alde carb في التمييز بين طفرات GABA التثبيطية، التي تظهر سلوك "هز الرأس" (head Bob) عند التعرض لـ PTZ ولكنها تكون مفرطة الحساسية لـ Alde carb، وبين الطفرات ذات القصور العام في الوظيفة التشابكية، والتي تظهر أيضاً سلوك "هز الرأس" عند التعرض لـ PTZ ولكنها تكون مقاومة لـ alde carb. علاوة على ذلك، يجب إدراك أن طفرات GABA التثبيطية تظهر سلوك "هز الرأس" عند التعرض لـ PTZ، بينما تظهر الديدان التي تفتقر إلى التنظيم السلبي للنقل الكوليني كأنها من النوع البري عند التعرض لـ PTZ.

وبناءً على ذلك، يمكن أيضاً استخدام مقايسة PTZ للتمييز بين هذه الفئات من طفرات النقل التشابكي، والتي تُبدي كلتاهما حساسية مفرطة تجاه Alde carb. وباختصار، فإن اتباع نهج تكميلي يجمع بين مقايسات PTZ وAlde carb سيتيح للباحث توصيف طفرات النقل التشابكي في C elegant بطريقة يستحيل تحقيقها باستخدام أي من العقارين بمفرده. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.