التصاق وتكدس الصفيحات تحت التدفق باستخدام خلايا تدفق ميكروفلويديك

يُعد نظام bio flux جهازاً مؤتمتاً وجهازاً للموائع الدقيقة لإجراء مقايسات الخلايا الحية تحت تدفق قصّ مُتحكم به. يستخدم هذا النظام تقنية الموائع الدقيقة للأطباق ذات الآبار لدمج أجهزة خلايا التدفق ذات المقياس الميكروني في أطباق آبار قياسية وفق مواصفات SBS. يمكن استخدام BioFlex لإجراء دراسات التصاق وتجمّع الصفائح الدموية بإنتاجية عالية وأحجام دم منخفضة.

يتم إضافة دم كامل مصنّع بصبغة فلورية إلى الآبار، ثم يُدفع للتدفق عبر القنوات. وتحت تدفق قصي محكوم، يتم الحصول على بيانات مجهرية عالية الدقة، والتي تحدد كمياً التصاق الصفائح الدموية وتجمعها في وجود مركبات دوائية ومعايير أخرى متغيرة. مرحباً، أنا مايك شوارتز من مختبر البحث والتطوير في شركة Flexion Biosciences.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخدام خلايا التدفق الموائعية الدقيقة في مقاييس التصاق الصفائح الدموية. نحن نستخدم هذا البروتوكول في مختبرنا لمجموعة متنوعة من مقاييس البيولوجيا الوعائية. لذا، لنبدأ.

قبل إجراء تجربة خلية التدفق، يجب تحضير القنوات الموائعية الدقيقة في لوحة bio flux بطلاء بروتيني مختار، وسيتم استخدام collagen one في هذه التجربة. تتصل كل قناة من القنوات التجريبية الـ 24 في لوحة bio flux ببئر مدخل وبئر مخرج لهذه اللوحة. بئر المدخل هو البئر الموجود على اليسار والذي يغذي القناة، وبئر المخرج موجود على اليمين؛ قم بتخفيف مخزون collagen one إلى تركيز 200 µg/mL.

في حمض الأسيتيك بتركيز 0.02 مولار، ستكون هناك حاجة إلى 20 ميكرولتر لكل قناة مستخدمة. وبما أن هذه التجربة تتطلب 11 قناة، قم بتحضير 200 ميكرولتر من تغليف الكولاجين. تبقى قناة واحدة غير مغلفة ويتم خلطها عن طريق التكرار اللطيف باستخدام رأس ماصة دقيقة.

أضف 20 µL من مادة التغليف إلى كل قناة مقابلة باستخدام ماصة دقيقة لتوزيع السائل في الثقب الداخلي للبئر. عند تغذية القناة الموائعية الدقيقة المعنية كما هو موضح هنا باستخدام الصبغة الصفراء، يجب تضمين قناة واحدة بدون كولاجين كعينة ضابطة سلبية لالتصاق الصفائح الدموية وتجمعها. بعد إضافة تغطية الكولاجين إلى جميع القنوات المقابلة، قم بتوصيل الواجهة بالصفيحة.

إذا كنت تستخدم واجهة bio flux 1000، يمكنك إغلاق كلا المزلاجين على المنصة. أما إذا كنت تستخدم واجهة Bio flux 200، فقم أولاً بربط البراغي الأربعة. وبمجرد تثبيتها جميعاً، استخدم مفك عزم الدوران لإحكام الربط تماماً.

سيصدر مفك عزم الدوران صوت نقرة عند وصوله إلى الحد الأقصى. باستخدام الوضع اليدوي في برنامج bio flux، قم بتطبيق التروية على القنوات المطلوبة بمعدل 2D لكل سنتيمتر مربع من المخرج. سنستخدم عدسة شيئية منخفضة القوة في المجهر لتحديد بئر المدخل ومراقبة ملء الثقب الداخلي المقابل بالسائل.

يجب أن تلاحظ أولاً قطرة صغيرة من السائل تملأ تدريجياً الثقب الداخلي بعد عدة دقائق، وعندما يمتلئ الثقب الداخلي للمدخل، أوقف التدفق في جميع القنوات بالضغط على زر الإيقاف (stop) في البرنامج. قم بتحضين الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وخلال فترة التحضين هذه، يمكنك البدء في تحضير الدم الكامل قبل نهاية ساعة التحضين.

بمجرد تحضير الدم، قم بإزالة الواجهة وأضف 1 mL من PBS مضافاً إليه أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم إلى بئر المخرج. ابدأ عملية التروية من بئر المخرج بمعدل 2 dyn/cm² واستمر في التروية لمدة 10 دقائق. بعد مرور 10 دقائق، أوقف عملية التروية. وبعد إزالة الواجهة، قم بإزالة الـ PBS الزائد من بئري المدخل والمخرج.

لا تقم أبداً بإزالة السائل الذي يملأ الثاقبة الداخلية. لسد القنوات، أضف 1 mL من محلول السد إلى كل مخرج. يجب تروية البئر المستخدم من بئر المخرج بمعدل 2 dL/cm²، مع الاستمرار في التروية لمدة 10 دقائق.

أوقف عملية التدفق بعد 10 دقائق وأزل الواجهة. أصبحت القنوات الآن جاهزة ويمكن استخدامها على مدار اليوم أثناء طلاء الصفيحة بالكولاجين. وخلال فترة تحضين لمدة ساعة واحدة، يجب تحضير دم بشري طازج من شخص صائم من أجل التصوير والضخ في الصفيحة.

يجب سحب الدم في سترات الصوديوم، كمادة مضادة للتخثر، واستخدامه في غضون ثلاث ساعات من عملية الجمع. أولاً، أضف محلولاً مخزوناً من calcium M بتركيز 4 mM في DMSO إلى الدم بتخفيف قدره 1 إلى 1000 حجماً مقابل الحجم. وللحصول على تركيز 4 µM من calcium am، يتم الخلط عن طريق القلب اللطيف للأنبوب.

بعد ذلك، يتم توزيع 1 mL من الدم المسمى بالكالسيوم في عشرة أنابيب دقيقة سعة 1.5 mL. يُضاف الجسم المضاد المثبط GP2B3 إلى كل أنبوب بالتخفيف المطلوب. تأكد من تضمين ضابط سلبي بدون جسم مضاد وضابط إيجابي بجسم مضاد غير ذي صلة، مع الخلط عن طريق القلب اللطيف للأنابيب.

يتم تحضين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، مع الخلط عن طريق القلب اللطيف كل 10 دقائق قبل إجراء تجربة خلية التدفق. يجب إعداد بروتوكول مؤتمت في وحدة تحكم bio flux للـ collagen.One. قم بإعداد بروتوكول لتشغيل الدم بمعدل عشرة تسعة سنتيمتر مربع لمدة 10 دقائق من المخرج.

حسنًا، باستخدام محطة عمل BioFlex 1000، يجب ضبط معلمات الحصول على البيانات، والتي تتضمن مواضع المسرح المطلوبة للحصول على الصور في الطول الموجي المحدد وإعدادات التصوير الزمني. تتكون خطة الحصول على الصور النموذجية لهذا البروتوكول من مجال رؤية واحد لكل قناة يتم التقاطه باستخدام عدسة شيئية 10x كل 30 ثانية على مدى مدة إجمالية تبلغ 10 دقائق. كما يمكن استخدام مجالات رؤية إضافية وإعدادات تصوير زمني بديلة.

بمجرد إعداد البروتوكول الآلي ومعلمات الحصول على البيانات، عُد إلى لوحة BioFlex وأزل السائل من كلا جانبي القناة باستثناء الثقوب الداخلية. مع الحرص على العمل بسرعة، ضع 500 µL من الدم لكل حالة في آبار المخرج لكل قناة. لاحظ أنه يتم استخدام آبار المخرج لإيصال الدم لأنها تمثل أقصر مسار إلى منطقة العرض، مما سيوفر استجابة فورية أكثر للدم تجاه طلاء الكولاجين.

بالإضافة إلى ذلك، ضع دم التحكم الخالي من الأجسام المضادة في قناة مطلية بالكولاجين وأخرى محجوبة فقط. ضع الطبق على مجهر محطة عمل BioFlex 1000 وثبته على الواجهة. قم بإجراء معايرة قائمة المنصة من خلال تحديد نقطة المعايرة الأولى التي تُعرف بأنها نقطة الأصل.

بعد ذلك، حدد نقطة المعايرة الثانية وقم بتأشيرها. طبق هذه المعايرة على قائمة المراحل المناسبة، وذلك لضمان إمكانية العثور على جميع مواقع العرض الموجودة على الطبق تلقائيًا.

حرك المنصة إلى إحدى القنوات التي تحتوي على الدم، وقم بضبط معاملات التقاط الصور مثل وقت التعرض (exposure time) والكسب (gain) في برنامج BioFlex montage. ابدأ سير العمل المناسب بالنقر فوق الزر المطلوب؛ سيؤدي ذلك إلى بدء بروتوكول التدفق واكتساب الصور في آن واحد.

في نهاية التجربة، قم بإزالة اللوحة من محطة عمل BIOFLU 1000 وتخلص منها وفقاً للإرشادات المؤسسية. باستخدام قنوات مائعية دقيقة مغلفة بالكولاجين من نظام bio flux، يُلاحظ تشكل خثرات دموية شديدة بمرور الوقت في عينة الدم الضابطة غير المعالجة.

في المقابل، لا يُلاحظ تشكل أي خثرة في القناة غير المطلية. وفي تجربة أُجريت مؤخراً، بلغ متوسط حجم التجمعات في ظروف التحكم 2000 micrometer squared. يُعد GP IIbIIIa وسيطاً قوياً للتفاعلات بين الصفائح الدموية واستقرار التجمع عند تنشيطه عن طريق الالتصاق بالكولاجين؛ وكما هو موضح هنا، لوحظ انخفاض في حجم الخثرات وكذلك انخفاض في تكرار تشكلها بعد التحضين مع جسم مضاد لـ GP IIbIIIa لمدة ساعة واحدة قبل التعرض لقوى القص.

يمكن ملاحظة استجابة معتمدة على الجرعة عادةً عند 10 dyn cm⁻²، وكانت قيمة IC 50 لهذا المثبط تحديداً 17 nM. وبلغ الحد الأقصى للتثبيط لهذا المانح مقارنةً بمجموعة التحكم الخالية من الأجسام المضادة 11% عند 10 dyn cm⁻². كما تتوفر لوحة ذات قص عالٍ مكونة من 48 بئراً لإجراء تجارب الدم الكامل بقوة قص تصل إلى 200 dyn cm⁻² أو 5,000 s⁻¹.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية استخدام قنوات التدفق الموائعية الدقيقة لإجراء تجارب في بيولوجيا الأوعية الدموية تكون ذات صلة فسيولوجياً. عند تطبيق هذا البروتوكول، من المهم تذكر تخفيف الكولاجين في المنظم الصحيح. اتبع دائماً تقنية السحب والتقطير الصحيحة لتجنب إدخال فقاعات الهواء، والتزم دائماً بلوائح السلامة البيولوجية المتبعة في مختبرك.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.