تحفيز الدماغ شريحة باستخدام شبكة ميكروفلويديك وستاندرد غرفة الإرواء

الهدف الرئيسي من المشروع الذي سنعرضه لكم اليوم هو القدرة على التحكم المكاني والزماني في تحفيز الدماغ. ونقطة رئيسية أخرى هي أنه باستخدام تعديل بسيط في الإعداد الكهرومغناطيسي المعقد بالفعل، يمكننا تعميم هذا الجهاز الموائع الدقيقة بين مختلف المختبرات التي تستخدم بالفعل تحفيز الدماغ. مرحباً، أنا جافا تشيك محمد من مختبر إيدينغتون في قسم الهندسة الحيوية بجامعة إلينوي في شيكاغو.

سأوضح لكم اليوم كيفية تطبيق جهاز مائعات دقيقة بسيط ومصنع مجهرياً لتحفيز شرائح الدماغ. إن جهاز شرائح الدماغ الذي سنقوم بعرضه اليوم مفيد للغاية لعدة أسباب، وأبرزها أنه نمطي لدرجة تمكنه من الاندماج في إعدادات الفسيولوجيا الكهربائية الحالية دون الحاجة إلى أي تعديلات إضافية. كما أنه يغني عن استخدام الأنابيب والمضخات، وهي الأمور التي تزيد من تعقيد أي جهاز للمائعات الدقيقة.

وبما أننا نستخدم طريقة الضخ السلبي، فإننا لا نحتاج إلى أي أنابيب أو مضخات. والأمر الثالث هو أنها مجرد رقاقة رقيقة من غشاء PDMS توضع بين شريحة غطاء وغرفة تروية قياسية، والتي تُستخدم في إعدادات الفسيولوجيا الكهربائية القياسية. تبدأ الإجراءات التي سأقوم بشرحها اليوم باستخدام قالب رئيسي من SU-8، والذي تم تصنيعه باستخدام عملية الليثوغرافي القياسية لـ SU-8.

والقالب الرئيسي الذي لدينا هنا اليوم هو قالب ذو مستويين؛ يحتوي أحد المستويات على تصميم القنوات، أي القنوات الدقيقة، بينما يحتوي المستوى الآخر على تصميم لفتحات عبرية تقع فوق هذه القنوات، بحيث يمكن للمحاليل التي تتدفق عبر القنوات أن تخرج من خلال هذه الفتحات العبرية. لذا نقوم بتصنيع هذا القالب الرئيسي على رقاقة سيليكون، ثم نستخدم السيليكون أو PDMS لصبّه فوق هذا الجهاز وتشكيل الهياكل الموجودة فوق هذه الرقاقة على الـ PDMS. لذا سنقوم بصب الـ PDMS فوق هذا الجهاز.

بعد ذلك، سنأخذ غشاء PDMS الذي تشكل بعد عملية المعالجة واللصق على شريحة غطاء. وبذلك يكون لدينا جهاز الموائع الدقيقة الخاص بنا. ثم سنقوم بتعديل غرفة تروية قياسية عن طريق طلاء طبقة رقيقة من PDMS على قاع غرفة التروية.

وبمجرد حصولنا على غرفة التروية المعدلة هذه، سنأخذ الجهاز الموائع الدقيقة الذي صنعناه سابقاً ونقوم بربطه بغرفة التروية. هناك نقطتان حاسمتان في تصنيع جهاز الموائع الدقيقة؛ الأولى هي أنه قبل وضع الـ PDMS، يجب إطفاء السخان المسطح لضمان عدم تصلب الـ PDMS فوراً عند صبه على الرقاقة.

ونقطة هامة أخرى هي أن الفواصل التي نستخدمها عند الزوايا الأربع لرقاقة السيليكون يجب أن يكون ارتفاعها أقل من أعلى هيكل موجود على رقاقة السيليكون. وذلك لضمان إمكانية الحصول على فتحات VR عند إجراء عملية المعالجة لـ PDMS. نحن هنا في هذه الغرفة النظيفة النمطية ذات الجدران اللينة، وهذا هو القالب الرئيسي الذي صنعناه باستخدام عملية ليثوغرافيا C eight القياسية.

وهي عبارة عن قالب رئيسي يتكون من مستويين، حيث يحتوي المستوى الأول على تصميم للقنوات بأربعة مداخل ومخرج واحد. وفي المنطقة الوسطى لجميع القنوات الأربعة، توجد فتحات اتصال (vias) أو أعمدة تبرز فوق القنوات. وهذه هي علامات المحاذاة التي تم إنشاؤها أثناء عملية التصنيع.

والآن سأوضح لكم كيفية إزالته والقيام بعملية معالجة الـ PDMS. نظرًا لتأثير حافة الخرز (edge bead effect)، فإن السمك في المحيط الخارجي للرقاقة يكون أكبر من الأجهزة الفعلية الموجودة في مركز الرقاقة. لذا، سنقوم بإزالة علامات المحاذاة هذه باستخدام شفرة الاحتياطي، ومن ثم لاستيعاب الأوزان، سنستخدم هذه الفواصل التي يبلغ ارتفاعها 140 micron وسنضعها في الزوايا الأربع للرقاقة.

لذلك، يجب التأكد من أن شفرة الحلاقة لا تصل إلى الأجهزة الفعلية. سأقوم الآن بإزالة جزيئات SVA هذه باستخدام منظف الهواء، وبذلك تصبح الرقاقة جاهزة لتحضير قالب PDMS. ولكن قبل القيام بذلك، نحتاج إلى وضع هذه الفواصل التي يبلغ ارتفاعها 140 micron.

سأقوم بوضع الأشرطة الأربعة عند الزوايا الأربع للرقاقة. ثم سأتأكد من التصاق الشريط بالرقاقة بشكل صحيح. والسبب في أن ارتفاع الشريط كان 140 micron هو أن القالب الرئيسي ذو المستويين الذي يحتوي على القنوات و VS يبلغ ارتفاعه 150 micron.

وعندما نضع الوزن فوق الـ PDMS أثناء عملية المعالجة، فإننا نرغب في التأكد من أن تكون شريحة الـ PDMS مسطحة. لذا، نستخدم أربعة فواصل عند الزوايا بأرتفاعات متساوية. سأوضح الآن كيفية صب الـ PDMS ومعالجته لتصنيع الأجهزة.

ولكن قبل القيام بذلك، اسمحوا لي أن أوضح لكم كيفية تحضير محلول PDMS. نقوم بأخذ 10 أجزاء من القاعدة وجزء واحد من عامل المعالجة ونخلطهما جيداً. ونظراً لعملية الخلط، تلاحظون تكون الكثير من الفقاعات في محلول PDMS؛ ولإزالة هذه الفقاعات، سنقوم بوضع PDMS في المجفف. وبعد وضع PDMS في المجفف لمدة 10 دقائق، تختفي جميع الفقاعات.

والآن أصبح الـ PDMS جاهزاً لعملية الإنضاج. سأوضح لكم الآن كيفية وضع الـ PDMS على الرقاقة وإنضاجه للحصول على غشاء الـ PDMS. لذا، سأقوم بوضع الـ PDMS على الرقاقة ثم استخدام هذه الشريحة الشفافة لتغطية الـ PDMS.

وسوف يساعدنا هذا في إزالة دعامة الجهاز، وفصل الجهاز عن الشريحة الشفافة، ومن ثم سأضع الأوزان فوق الشريحة الشفافة. والسبب في استخدام الأوزان هو الحصول على سماكة موحدة لـ PDMS. وهناك مسألة بالغة الأهمية الأخرى وهي الحصول على فتحات الممرات (via openings).

وبالتالي، في جميع المناطق التي يظهر فيها الرمز vs، فإننا لا نريد وجود PDMS، وستساعدنا الأوزان في تحقيق ذلك. كما تلاحظون هنا، فإن لوح التسخين مغلق، والسبب في ذلك هو أننا لا نريد أن يتصلب PDMS فوراً، لذا نتركه مغلقاً. ومن ثم، يجب التأكد من أن الرقاقة مسطحة تماماً قبل صب PDMS.

والآن يمكننا نقل الـ PDMS الذي قمنا بتحضيره مسبقاً. تأكد من توزيع الـ PDMS بالقرب من الرقاقة بما يكفي لتجنب تكوين فقاعات. والنقطة الأكثر أهمية هنا هي طريقة وضع الشفافية فوق الـ PDMS.

يجب التأكد من عدم تكوين فقاعات نتيجة لوضع الورقة. والآن سأقوم بوضع إحدى هذه الشرائح الزجاجية والسماح لزيادة الـ PDMS بالخروج. سأضع ثلاث شرائح زجاجية أخرى لضمان عدم تحرك الشرائح الزجاجية بالنسبة لهذا القالب الرئيسي تحديداً.

وبالنسبة لهذه الميزات تحديداً، وجدنا أن وضع هذه الشرائح الزجاجية الأربع يجعل الـ VS، وللسماح لـ PDMS الزائد بالخروج من المسافة بين الشفافية والرقاقة. ننتظر لمدة دقيقة إلى دقيقتين ثم يمكننا بدء تشغيل السخان الكهربائي؛ فبالنسبة للقوالب المختلفة والتصاميم المختلفة، قد تحتاج إلى زيادة عدد الشرائح الزجاجية أو تقليلها من أجل الحصول على فتحات عبرية. الآن أصبح السخان جاهزاً للتشغيل وسأقوم بضبط درجة الحرارة على 75 درجة.

وبمجرد وصول درجة الحرارة إلى 75 درجة، يمكننا ضبط المؤقت لمدة ساعة واحدة وترك الـ PDMS يتصلب. والآن، بعد أن تركنا الـ PDMS يتصلب لمدة ساعة، يمكننا إطفاء اللوح الساخن وتركه يبرد حتى يصل إلى 50 درجة مئوية. والسبب في القيام بذلك هو ضمان عدم تشقق الـ SEA.

إذا قمنا بنقلها فوراً من 75 درجة إلى درجة حرارة الغرفة، يمكننا الآن إطفاؤه والانتظار حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية. والآن بعد أن انخفضت درجة حرارة اللوح الساخن إلى 50 درجة مئوية، يمكننا إزالة الأثقال من فوق الشريحة الشفافة. والآن يمكننا إزالة الرقاقة من اللوح الساخن، وتصبح جاهزة للقص.

الآن أصبحت شريحة PDMS جاهزة للإزالة من القالب الرئيسي C eight، وعلينا إزالة رقاقة الألومنيوم. بعد ذلك، نحتاج إلى إزالة شريحة الشفافية. لدينا هنا غرفة تروية قياسية.

لقمنا بتعديله بحيث يمكننا محاذاته. الفتحات، ومنافذ الدخول والخروج للجهاز الموائع الدقيقة. لذا، هذه هي منافذ الدخول الأربعة ومنفذ الخروج الواحد الموجود على غشاء PDMS.

ويجب أن تتطابق هذه مع المداخل الأربعة والمخرج الواحد في غرفة التروية. سأقوم الآن بتمرير غرفة التروية ثم محاذاتها مع الثقوب الموجودة على غشاء PDMS. وبعدما تمت محاذاتهما، تصبح الغرفة جاهزة للقص.

يمكنك الآن إخراج الغرفة باستخدام مسبار. تأكد من أن جميع حواف غشاء PDMS حرة وقابلة للإزالة. بمجرد القيام بذلك، يمكننا استخدام مجمد لإزالة غشاء PDMS، واحرص عند إزالة PDMS من أعلى الجهاز على تحريك PDMS ببطء شديد لتجنب تمزيق غشاء PDMS.

سأقوم الآن بوضع غشاء PDMS الذي يحتوي على التجويفات التي تم تشكيلها باستخدام قوالب SC eight في الأعلى، والتأكد من استوائه. والسبب في القيام بذلك هو ضمان عدم خشونة سطح PDMS من الجانب الذي سيتم ربطه بالشريحة الغطاء عند عمل الثقوب، وهي منافذ الدخول والخروج.

لذلك، يجب التأكد من وجود التجويفات في الجانب العلوي. الآن يمكننا إنشاء منافذ الدخول والخروج حتى نتمكن من رؤية الثقوب بوضوح، وذلك بوضع خلفية سوداء.

سأقوم الآن بعمل فتحات الدخول والخروج، ويجب التأكد من عدم وجود أي بقايا من PDMS عند الفتحة. لذا، سنقوم بإزالة أي PDMS. والآن سنقوم بنقل غشاء PDMS إلى ورقة شفافية أخرى.

لذا يمكننا معالجة الشريحة والغطاء الزجاجي بالبلازما ووضعهما بحيث تظل التجويفات في الأعلى. وبمجرد معالجة هذا السطح بالبلازما ومعالجة الغطاء الزجاجي بالبلازما، يمكننا دمج هذين السطحين لتكوين الشبكة الموائع مجهرية لإزالة فقاعات الهواء الموجودة بين شريحة PDMS. ويمكن استخدام شريط لاصق لضمان الشفافية.

سيضمن ذلك أن تكون شريحة PDMS مسطحة، مما يجعل عملية الربط أفضل بكثير. بعد ذلك، استخدم الشريط اللاصق على السطح العلوي لإزالة أي غبار من غشاء PDMS. الآن يمكننا وضع الشريحة الزجاجية (cover slip) التي سنقوم بربطها بغشاء PDMS.

والآن أصبح هذان القطعتان من PDMS والزجاج جاهزين للمعالجة بالبلازما. سنقوم بمعالجة PDMS والشريحة الغطائية باستخدام نظام البلازما المعدل بالميكروويف هذا، حيث يمكنك رؤية أن هذه الغرفة الزجاجية تسمح لنا بتوليد البلازما داخل الميكروويف. واسمحوا لي بوضع العينات في الداخل مع تفريغ الهواء لإنشاء فراغ داخل الغرفة.

يمكنني الآن تدفق الأكسجين. أصبح نظام البلازما الآن جاهزاً للتشغيل، وسأستخدم قدرة 10% ولمدة 10 ثوانٍ لهذا النظام تحديداً للمساعدة في رؤية البلازما. وأثناء استمرار معالجة البلازما، قمنا برفع القدرة إلى مائة بالمائة وأطفأنا الأنوار.

ويمكنك الآن رؤية البلازما مباشرة بعد المعالجة بالبلازما. يجب عليك ربط كلا السطحين، الشريحة الزجاجية والـ PDMS، وإلا سيفقد سطح الـ PDMS خاصيته المحبة للماء نتيجة للمعالجة بالبلازما. وبمجرد وضع الشريحة الزجاجية، تأكد من ربط السطح بالكامل معاً دون وجود أي فقاعات هوائية.

إذا وجدت أي فقاعات هوائية، يمكنك إزالتها. الآن، اتركها جانباً لمدة خمس دقائق للسماح لها بالتصلب. لدينا هنا غرفة التروية المعدلة، حيث قمنا بتعديل قاعدة الغرفة باستخدام PDMS.

وقد تم تنفيذ هذه الخطوة مسبقاً؛ حيث وضعنا ورقة شفافة على لوح تسخين كان مطفأً، ثم سكبنا الـ P-D-M-S الذي تم تحضيره بطريقة مماثلة لما تم عرضه سابقاً.

ثم وضعنا غرفة التروية فوق الـ PDMS، وبعد ذلك وضعنا ثقلاً واحداً كما هو موضح هنا، وتركناه ليتصلب لمدة 30 دقيقة عند 75 degrees centigrade. والآن سأوضح، بينما ننتظر حدوث عملية الربط بين الـ PDMS والغطاء الزجاجي، أنه يمكننا المضي قدماً في تحضير الغرفة؛ حتى نتمكن من ربط الغرفة بالجهاز الموائع الدقيقة.

لذا، نحتاج إلى إزالة فائض الـ PDMS من كافة المواضع التي لا نحتاجه فيها. ابدأ بإزالة الغشاء الشفاف ثم الـ PDMS، وبعد ذلك نحتاج إلى إزالة الـ PDMS من منافذ المدخل والمخرج. الآن أصبحت الحجرة جاهزة للربط مع الجهاز الموائع الدقيقة الذي قمنا بتجهيزه مسبقاً.

بعد الانتظار لمدة خمس دقائق، أصبح الجهاز الموائع دقيقية جاهزاً للفصل عن الورقة الشفافة، ولكن يجب التأكد من إزالة الورقة الشفافة ببطء، لضمان عدم انفصال الـ PDMS عن الشريحة الغطائية. والآن بعد أن أصبحت غرفة التروية جاهزة، نحتاج إلى معالجة السطح السفلي للغرفة حيث قمنا بتغطية الـ PDMS، وكذلك السطح العلوي لجهاز الموائع دقيقة الذي يحتوي على الـ PDMS، باستخدام البلازما.

سنقوم الآن بوضع هاتين القطعتين في غرفة البلازما وإجراء معالجة بالبلازما عند قدرة 10% لمدة 10 ثوانٍ. الآن تم معالجة كلا السطحين بالبلازما وأصبحا جاهزين للربط. قبل البدء بعملية الربط، يجب التأكد من محاذاة منافذ الدخول والخروج في الغرفة مع الجهاز الموائع الدقيقة.

وبما أن الميزات التي نقوم بمحاذاتها كبيرة بما يكفي، فإننا لسنا بحاجة إلى أي معدات خاصة ويمكننا القيام بذلك بالعين المجردة. وبمجردما تقوم بالمحاذاة والوضع فوق الغرفة، تأكد من أن جميع الأسطح متصلة، ثم يمكنك تركها لمدة خمس دقائق. وبذلك يكون الترابط كافياً لإجراء التجارب بعد الانتظار لمدة خمس دقائق.

الآن وبعد أن تم ربط الجهاز الموائع الدقيقة بالغرفة، سنقوم بجعل القنوات في سطح القناة محبة للماء. وبذلك، عندما نقوم بتدفق محلول A CFS أو أي من الناقلات العصبية الأخرى، يمكن للمحاليل أن تتدفق بسهولة أكبر. لذا، سأقوم بوضع هذا الجهاز بالكامل في البلازما، ومعالجته بالبلازما لمدة دقيقة واحدة بنسبة 10% لكي تصبح جميع أسطح القنوات الداخلية محبة للماء.

وبعد ذلك، سأقوم بملئه بالماء ثم نقله إلى وحدة الفيزيولوجيا الكهربائية حتى نتمكن من إجراء التجارب الفعلية. حسناً، نحن الآن مستعدون للانتقال إلى وحدة الفيزيولوجيا الكهربائية واستخدام هذا الجهاز فعلياً مع الشريحة الدماغية. مرحباً، اسمي uo.

أعمل مع الدكتور Arrington والدكتور Fall في قسم الهندسة الحيوية بجامعة إلينوي. وسأقوم الآن بالعمل باستخدام جهاز micro free الذي أحضرته ووضعته فوق هذه المنصة. ويمكننا أن نرى في أحد الجوانب أنابيب التروية.

في الجانب الآخر، يمكننا رؤية أنبوب السحب. سيتم تروية الجهاز بمحلول CSF، والذي يتم فقعه بنسبة 95% من الأكسجين و5% من CO2. الآن وبعد أن أصبح جهاز micro V جاهزاً، سأقوم بإحضار شرائح الدماغ ومن ثم سأضعها فوق الجهاز الدقيق.

سأقوم الآن بوضع شريحة الدماغ فوق الفتحات الدائرية، ثم سأستخدم المرساة لتثبيت شريحة الدماغ. والآن بعدما تم تثبيت شريحة الدماغ، سأستخدم الناقلات العصبية لتحفيزها. يتوفر لدينا هنا أربع مداخل، لذا سأضع الناقل العصبي في كل مدخل باستخدام الضخ السلبي من هذه المداخل الأربعة وصولاً إلى هذا المخرج.

والآن سيتحدث الدكتور Fall عن هذا الجهاز، وما الذي يجعله مهماً بالنسبة لنا؟ مرحباً، أنا كريس Fall ونحن متخصصون في فيزيولوجيا الدماغ.

والسبب في حاجتنا لاستخدام شرائح الدماغ هو إتاحة الوصول باستخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة وتكنولوجيا التصوير. وحتى الآن، كانت الطريقة الوحيدة التي يمكننا من خلالها تغيير بيئة الناقلات العصبية لهذه الشرائح الدماغية هي تغيير التدفق فوق الشريحة بأكملها أو نفخ الناقلات العصبية مباشرة باستخدام ماصة دقيقة صغيرة جدًا. لذا، نحن متحمسون حقًا للعمل مع مجموعة إدينجتون.

ستسمح لنا هذه التقنية الجديدة بالتعامل مع مناطق واسعة من الدماغ وتغيير بيئة الناقلات العصبية محلياً. ومن ثم يمكننا الآن بالتزامن استخدام الأقطاب الكهربائية وتقنيات التصوير الخاصة بنا، وربما دمج أجهزة تسجيل متعددة الأقطاب في الوحدة ذاتها مستقبلاً. حسناً، ترون هنا شريحة من دماغ فأر داخل جهاز الموائع الدقيقة.

ويمكنكم ملاحظة ذلك حتى بالعين المجردة، حيث يتكون الدماغ من مناطق مختلفة عديدة. وتقوم هذه المناطق بوظائف مختلفة. وفي الحيوان الحي، يكون لهذه المناطق المختلفة في الدماغ نغمات مختلفة من الموصلات العصبية والمعدلات العصبية.

ونحن نرغب في أن نكون قادرين على تكرار ذلك في غرفة الشرائح أثناء إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية والتصويرية. لذا، فمن المفيد جداً أن نتمكن من استهداف هذه المناطق المختلفة بنواقل عصبية مختلفة وبتراكيز متباينة وجداول زمنية مختلفة. وبينما لا يمكننا تصور النواقل العصبية فعلياً، يمكننا أن نعرض لكم هنا مثالاً لصبغة فلورية يتم ضخها في مناطق مختلفة من شريحة الدماغ.

تظهر هنا لقطة سينمائية نقوم فيها بتمرير صبغة فلورية عبر قنوات الجهاز، ونقوم فقط بتصوير خروجها من المسام التي تم إنشاؤها. وحتى في هذا النموذج الأولي، يمكنك ملاحظة مدى دقة الدقة المكانية في التدفق. وبينما نشاهد المقطع، سترى الصبغة وهي تتدفق إلى القنوات ثم تخرج من الثقوب، وبعد ذلك سنقوم بغسل تلك الصبغة، مما يمنحك فكرة عن الدقة الزمنية لهذا التدفق.

شكراً لانضمامكم إلينا اليوم. أعتقد أننا تمكنا من توضيح كيف يمكن دمج الموائع الدقيقة، بل والآلات الدقيقة، مع التقنيات الفسيولوجية التقليدية لمساعدتنا في فهم كيفية عمل الدماغ. شكراً لكم.