على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

الهدف العام من هذا المقال المرئي هو تقديم إجابات على السؤالين التاليين: أولاً، هل يمكن إجراء دراسات تفاعلات البروتين بشكل أكثر موثوقية من خلال قياس جزء عينة البروتين القادر فعلياً على الارتباط ببروتين آخر؟ وثانياً، كيف يمكن للتحليل الحركي أن يمنحنا فهماً أفضل للعلاقات بين البنية والوظيفة؟

سيتم تناول كلا هذين السؤالين في تجربة تتضمن جهاز Corp X 100، وهو جهاز يرصد التفاعلات البروتينية في الوقت الفعلي دون استخدام علامات. ستفحص هذه التجربة التفاعل بين cystatin B البقري وبروتياز السيستين papain، حيث يشير التركيب البلوري للبروتينين في المعقد إلى عدة بقايا تشارك في الارتباط بالبروتياز لتحديد كيفية تأثير كل من البقايا المتفاعلة على التفاعل بين cystatin B وpapain. ويتم إنتاج عدة متغيرات من cystatin B عبر الطفرات الموجهة للموقع.

في مثل هذه التجارب، هناك احتمالية دائمة ألا تنطوي البروتينات المأشوبة بشكل صحيح، أو أن تتجمع أو تتدهور، مما يؤدي إلى نتائج غير صحيحة وغير قابلة للتكرار. يمتلك جهاز VIACORE X 100 القدرة على تحديد جزء البروتين المتاح للارتباط من خلال تحليل التركيز الخالي من المعايرة، والمشار إليه اختصاراً بـ CFCA. يتيح هذا النهج تحديد تركيز البروتين الذي يحتفظ بنشاط الارتباط حتى في حالة عدم توفر معايير المعايرة.

سيتم استخدام CFCA هنا لتحديد تركيز متغيرات cystatin B. بعد ذلك، ستُستخدم هذه البيانات كمدخلات في تحديد حركية الارتباط لمتغيرات cystatin B بـ Pepin، والتي يتم تقييمها أيضاً باستخدام BOR X 100. مرحباً، أنا CLA gram من شركة GE Healthcare في السويد.

ستوضح لك زميلتي إيفا بول اليوم كيفية إجراء تحليل علاقة البنية بالوظيفة باستخدام BOR X 100. قد تُظهر البروتينات المؤشبة طياً غير صحيح أو تفقد نشاطها بمرور الوقت، ولا يمكن اكتشاف هذا السلوك بواسطة الطرق التي تعتمد على قياس التركيز الكلي. قد يؤدي ذلك في الواقع إلى بيانات حركية غير صحيحة بعد قياسات التركيز باستخدام تحليل التركيز الخالي من المعايرة. يُستخدم B.A core X 100 لتحليل حركية وألفة التفاعل بين متغيرات cystatin B وpepane.

ستوفر هذه المعلمات نظرة ثاقبة حول آلية الارتباط. سنبدأ بشرح موجز للتصميم التجريبي، لذا فلنبدأ. يهيمن التلامس الكاره للماء على التفاعل بين السيستين، والبروتياز، والبابين، والمثبط cystatin B كما كشف التركيب البلوري لبروتيني المركب.

من جهة المثبط، تتمثل مناطق التلامس في ذرات النيتروجين في الطرفين N وC، وحلقتين من نوع دبوس الشعر (hairpin loops). في هذه الدراسة، تم فحص أربع طفرات، تحتوي كل منها على طفرات استبدال للسيستين لمنع تضاعف السلسلة البروتينية (dimerization) في السيستاتين B. وبناءً على السياق الذي كشف عنه التركيب البلوري، تم تحويل الليوسين 73 إلى جلايسين، والهيستيدين 75 إلى جلايسين، وتغيير التيروزين 97 إلى ألانين. وقد أُدخلت طفرتا الجلايسين لفحص أهمية السلاسل الجانبية للهيستيدين 75 والليوسين 73 في الارتباط بـ Pepin، بينما تم تحويل بقايا التيروزين إلى ألانين لدراسة التفاعل بين الطرف C للسيستاتين B و Pepin.

تم اختبار الطفرات المزدوجة الثلاث بالإضافة إلى الطفرة الأحادية السورية INE three لتحديد تفاعلها مع بديل غير نشط تحفيزياً من Papain S methyl popin. هذا الشكل غير النشط تحفيزياً من البروتياز يحتوي على مجموعة ميثيل مرتبطة بـ CYS 25 في الشق النشط. وللتبسيط، سنطلق على هذا البديل اسم propan طوال البروتوكول.

تعتمد تقنية CFCA على قياس معدل الارتباط في ظل ظروف يكون فيها المعدل محدوداً بانتشار جزيئات المادة التحليلية إلى السطح. ويتم تعزيز ذلك من خلال مستويات تثبيت عالية للربيطة. قبل البدء في إجراء التثبيت، ضع محلول HEPs المنظم المستخدم في التجارب في الصينية اليسرى وأدخل كلا الأنبوبين.

ضع أيضاً زجاجة نفايات فارغة على الصينية اليمنى. ثم أدخل مستشعر جبس جديد (sensor gypsum five) في الجهاز، وقم بتشغيله عبر برنامج core X 100، وفي شاشة البدء، انقر فوق عنصر أداة شريحة الإرساء (dock chip tool). انقر فوق بدء الإرساء (start doc) في البرنامج.

بعد ذلك، استخدم معالج التثبيت (immobilization wizard) لإعداد عملية التثبيت من خلال توجيه عملية الربط (coupling) إلى المستشعر CM5؛ فمن شاشة البداية، انقر على زر "خيارات أخرى" (other options)، ثم اختر "المعالجات" (wizards). ستظهر نافذة تحتوي على المعالجات المتاحة، اختر "التثبيت" (immobilization) ثم انقر على زر "جديد" (new) في أسفل اليمين، لتظهر الشاشة الأولى من معالج التثبيت، حيث يكون "توجيه الربط إلى المستشعر CM5" هو الخيار الافتراضي.

حدد المربع الموجود أسفل خلية التدفق الثانية للتثبيت في خلية التدفق الثانية. تترك خلية التدفق الأولى دون تعديل لاستخدامها كسطح مرجعي من الخيارات الثلاثة المتاحة أدناه. حدد مربع "تحديد وقت التلامس" (specify contact time) على اليمين ليتغير المستوى المستهدف إلى وقت التلامس، ثم حدد وقت تلامس قدره 900 seconds.

بعد ذلك، أدخل معاملات التثبيت تحت خيار محلول جزيء الالتقاط/الرابط. أدخل papain. ثم انقر فوق التالي.

تعرض الشاشة التالية مخطط حامل العينات. سيحتوي الموضع الأول على ethanolamine المستخدم لإلغاء تنشيط المجموعات النشطة المتبقية بعد عملية ربط ligand papain بسطح الرقاقة. أدخل محلول ethanolamine في الموضع الأول وفي الموضع الثاني.

ضع الربيطة باباين papain؛ حيث يُخزن الباباين في فائض من كبريتات الميثيل ويُخفف إلى 50 micrograms لكل milliliter في محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز 10 millimolar ورقم هيدروجيني pH 4.5. أعد تكوين كواشف الربط EDC وNHS من مجموعة ربط الأمين باستخدام ماء مقطر مرتين، ثم اسحب 85 microliters من EDC بواسطة الماصة في أنبوبة، أغلقها بإحكام وضعها في الموضع الثالث.

استخدم الحجم نفسه من NHS في الموضع الرابع. لاحظ أنه يجب أن يكون الملف الخامس مغطىً وفارغًا لكي يقوم الجهاز بخلط ED وC وNHS في هذا الملف. تذكر أيضًا ملء ملف الغسيل في الموضع H2O بماء منزوع الأيونات حديث.

عندما يتم ملء الحامل وفقاً للمخطط الموضح على الشاشة، انقر فوق "load samples" ثم قم بتحميل الحامل في الجهاز. وبمجرد تحميل الحامل، انقر فوق "next". وقبل بدء التشغيل، ستظهر قائمة مراجعة.

تأكد من استيفاء جميع النقاط المذكورة عند تحققها. يبدأ التشغيل بالضغط على زر البدء. يتم بدء التشغيل أثناء إجراء التثبيت.

يتم جمع البيانات في الوقت الفعلي. أولاً، يتم حقن كواشف الربط. بعد ذلك، يتم ربط الببتيد بسطح الشريحة، وتنتهي العملية بإلغاء تنشيط الإسترات النشطة المتبقية.

بعد انتهاء التشغيل، تظهر نافذة حوار تلخص نتيجة العملية. ويُعرض في هذه النافذة مستوى التثبيت. يجب أن تؤدي عملية الربط بأكملها إلى تثبيت حوالي 3000 RU من الباباين.

بمجرد تثبيت الباباين على شريحة المستشعر، ابدأ تحليل CFCA عن طريق تخفيف عينات طفرة السيستاتين B إلى تركيز إجمالي يبلغ حوالي 10 nanomolar في 300 microliters على الأقل. سجل عامل التخفيف حيث سنستخدمه لاحقاً في إعداد المقايسة. ابدأ بفتح مربع حوار المعالج كما هو موضح في القسم السابق في قسم التركيز بمجلد المقايسة.

اختر "معايرة مجانية" (calibration free)، ثم اختر "جديد" (new). تظهر الشاشة الأولى من المعالج تسلسل الحقن. يمكن ترك الإعدادات دون تغيير نظراً لاستخدام شريحة المستشعر CM five ونهج مقايسة التثبيت المباشر هنا.

انقر على "التالي" في الشاشة التالية. اترك مربعات الاختيار "التحضير قبل التشغيل" (prime before run) و"دورات بدء التشغيل" (run startup cycles) محددة. كما يجب ترك العدد الافتراضي لدورات بدء التشغيل دون تغيير عند ثلاثة.

أدخل heaps buffer في حقل اسم المحلول. ثم انقر فوق التالي. وفي الشاشة التالية، أدخل اسم محلول التجديد، وهو 20 millimolar sodium hydroxide.

اترك المعلمات الأخرى دون تغيير. انقر فوق "التالي" لعرض جدول العينات. قم بإعداد العينات وفقاً لجدول العينات.

ينتج عن كل صف في جدول العينات دورتان؛ إحداهما بمعدل تدفق 10 µL في الدقيقة والأخرى بمعدل 100 µL في الدقيقة. ابدأ التشغيل بعينة فارغة (blank).

بعد ذلك، أدخل اسم عامل التخفيف ومعامل الانتشار عند 20 °C والوزن الجزيئي. بالنسبة لكل طفرة، يمكن حساب معامل الانتشار باستخدام الأداة المتاحة على الموقع الإلكتروني للمنتج. ويتوفر رابط لهذه الأداة في متصفح الدعم الخاص بالبرنامج.

بما أنه يُوصى بتشغيل كل عينة مكررة، قم بنسخ الجدول بأكمله من الصف الفارغ إلى العينة الأخيرة ثم الصقه في أسفل الجدول. انقر فوق "التالي" للمتابعة. تعرض الشاشة التالية حامل العينات.

ضع العينات والكواشف في الحامل وفقاً للمخطط المحدد بواسطة البرنامج. قم بتحميل الحامل في الجهاز بالضغط على زر تحميل العينات. ثم انقر فوق التالي.

بعد تحميل العينات، تظهر شاشة تذكير تحتوي على قائمة مراجعة. تأكد من مراجعة كافة البنود ثم اضغط على زر البدء. يتم جمع البيانات في الوقت الفعلي أثناء التشغيل.

عند اكتمال التشغيل، أغلق النافذة التي تعرض البيانات التي تم جمعها. لاحظ ظهور عنصر نتيجة جديد في النافذة الرئيسية. ومن أجل حساب التركيزات من البيانات، حدد عنصر النتيجة الجديد وانقر فوق الزر.

قم بإجراء التقييم باستخدام core X 100. يتم تشغيل برنامج التقييم لعرض جميع البيانات التي تم جمعها، ومن شريط الأدوات، اختر تحليل التركيز (concentration analysis)، ثم اختر "التحرير من المعايرة" (calibration free) من القائمة. وفي النافذة الأولى، حدد البيانات المراد تضمينها في التحليل.

قم بالتمرير عبر القائمة والانتقال عبر قائمة العرض لمشاهدة البيانات الخاصة بجميع العينات. إذا كنت ترغب في استبعاد أي بيانات، قم بإزالة علامة الاختيار من القائمة. انقر فوق "التالي" لبدء الحساب.

يتم ملاءمة نموذج تفاعل CFCA تلقائياً مع البيانات التجريبية، وعند اكتمال الملاءمة، يتم عرض النتائج لكل عينة في نافذة النتائج. انتقل عبر عمليات الملاءمة لكل عينة عن طريق تحديد الصف المقابل في الجدول. يوضح العمود المسمى "التركيز المقاس" التركيز الموجود في العينة التي تم تحليلها.

يتم حساب التركيز في العينة الأصلية باستخدام عامل التخفيف الذي تم إدخاله سابقاً، ويظهر ذلك في عمود التركيز المحسوب؛ عند الانتهاء، انقر على "إنهاء" لحفظ النتيجة. الآن وبعد أن عرفنا تركيزات البروتينات من تحليل CFCA، أصبح لدينا أساس ممتاز لقياسات الحركية اللاحقة. سيساعدنا تحليل الحركية الآن على فهم أهمية بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية في آلية الارتباط.

لنبدأ بإعداد التحليل الحركي. يبدأ التحليل الحركي بتركيب شريحة مستشعر جديدة من نوع CM five في الجهاز من خلال شاشة البدء. اختر إنشاء سير عمل مقايسة لتقارب الحركية.

في الزاوية العلوية اليسرى، تظهر نافذة حوار يتم من خلالها إدخال المعلومات الخاصة بالربيطة. أدخل الاسم papain في مربع اسم الربيطة واختر بروتينًا آخر من قائمة أنواع الأنواع. بعد ذلك، اختر تثبيت الربيطة تساهميًا باستخدام رقاقة المستشعر CM five من نهجي تثبيت الربيطة البديلين المعروضين، وسيظهر الآن مخطط سير عمل المقايسة الموصى به على الجانب الأيمن من النافذة.

تبدأ العملية بخطوة التثبيت تليها خطوة المقايسة. اضغط على متابعة للمضي قدمًا. احفظ سير عمل المقايسة كما هو مطلوب عن طريق إدخال اسم ثم الضغط على حفظ.

يوضح البرنامج الآن سير عمل المقايسة مع وجود أزرار مرتبطة بكل خطوة. تتمثل الخطوة الأولى ضمن تحضير سطح المستشعر في إيجاد pH التعبئة. ونظرًا لأن قيمة pH هذه معروفة، اضغط على "إدخال قيمة معروفة" في مربع الحوار الذي يظهر.

أدخل اسم المنظم acetate والقيمة pH 4.5 ثم اختر حفظ. سيتم الآن تحديث سير عمل المقايسة بعلامة اختيار خضراء للإشارة إلى اكتمال هذه الخطوة. حان الوقت الآن للتثبيت، اضغط على زر التشغيل في خطوة التثبيت.

يؤدي هذا إلى ظهور المعالج نفسه الذي تم استخدامه مع البروبان والتثبيت لتحليل CFCA؛ حيث يتم إعداد تثبيت البابين للتحليل الحركي بنفس الطريقة هنا، باستثناء حقن محلول أكثر تخفيفاً لفترة زمنية أقصر. يهدف ذلك إلى تثبيت كمية أقل من البابين لتجنب الحالات التي تكون فيها معدلات ارتباط طفرات السيستاتين محدودة بالانتشار، وبذلك يمكن قياس البيانات الحركية بشكل منعزل. ونظراً لأنه تم إدخال اسم اللجين ودرجة الحموضة pH الخاصة بالتثبيت في خطوات سابقة من سير عمل المقايسة، فقد تم ضبط كليهما مسبقاً هنا.

التحديث المطلوب الوحيد هو جعل وقت التلامس 50 seconds. بعد ذلك، تستمر عملية التثبيت كما تم توضيحها سابقاً. مستوى الارتباط المتوقع بعد التثبيت هو 50 R ru.

تشير علامة الصح الخضراء بجانب زر التشغيل إلى اكتمال عملية التثبيت. بعد ذلك، أدخل محلول التجديد في تدفق العمل في الخطوة المحددة. ابحث عن شروط التجديد من خلال النقر على "إدخال القيم المعروفة" في مربع الحوار الذي يظهر.

أدخل محلول التجديد ووقت التلامس، ثم انقر فوق حفظ. الآن بعد تثبيت الربيطة وإدخال شروط التجديد، أصبح كل شيء جاهزاً لإنتاج بيانات الحركية؛ في مربع مقايسة ألفة تشغيل الحركية، اضغط على زر التشغيل لبدء الخطوة الأولى في دراسة الحركية.

يوضح معالج الألفة (Affinity wizard) تسلسل الحقن لكل دورة بالنسبة لحركيات الدورة الواحدة، وهو الخيار المستخدم هنا، لذا لا داعي لتغيير أي شيء. انقر فوق "التالي" (next) للمتابعة. في الخطوة التالية، احتفظ بالإعدادات الافتراضية التي تشير إلى تهيئة النظام قبل التشغيل.

اختر تشغيل دورة بدء واحدة من أجل موازنة سطح الشريحة. بعد ذلك، حدد معلمات الحقن الخاصة بالعينة. ونظراً لأن محلول التجديد قد تم تحديده مسبقاً والإعداد معرف مسبقاً، فلا داعي لتغيير أي من المعلمات في الشاشة.

انقر على التالي. أخيراً، حدد العينات. أدخل صفين لكل متغير طافر، أحدهما فارغ والآخر يحتوي على العينة.

يتم تحديد الدورة الفارغة عن طريق ضبط معلمة أعلى تركيز على صفر. يمكن إدراج متغيرين من Cystatin B في كل تشغيلة. لكل طفرة، أدخل الوزن الجزيئي، وأعلى تركيز، وعامل التخفيف، ثم اضغط على التالي.

في الشاشة التالية، تم تحديد رف العينات. قم بتحضير سلسلة تخفيف لعينات البروتين وضع القوارير مع أغطيتها في الرف. كما هو موضح على الشاشة، يتم وضع قارورة تحتوي على المحلول المنظم (buffer) في الموضع 13، وقارورة تحتوي على محلول التجديد في الموضع 14. تأكد من ملء موضع الماء بماء نقي.

ضع الحامل في الجهاز وقم بتحميل العينات بالضغط على زر تحميل العينات (load samples) ثم انقر على التالي (next). وكما سبق، قم بإجراء فحص نهائي قبل البدء في تشغيل التجربة بالضغط على زر البدء (start)، حيث ستظهر بيانات التفاعل في الوقت الفعلي. عند انتهاء التشغيل، ابدأ فوراً بتشغيل متغيرات cystatin B المتبقية وفقاً لما تم توضيحه للتو.

إذا تم تشغيل متغيرات cystatin B المتبقية على التوالي، فقم بإلغاء خطوة التحضير (prime) ودورة البدء عن طريق إلغاء تحديد مربعات الاختيار المقابلة في الخطوة. وعندما يتم الانتهاء من كل عملية تشغيل، يمكن الوصول إلى البيانات من الرابط. تتوفر جميع النتائج في سير عمل المقايسة.

تظهر نافذة حوار تحتوي على جميع النتائج التي تم إنشاؤها ضمن مسار العمل هذا. ومن أجل حساب ثوابت معدل الحركية، اختر النتيجة المراد تقييمها ثم اضغط على evaluate، ليبدأ برنامج التقييم core X 100 مرة أخرى في عرض جميع البيانات المجمعة. اختر kinetics affinity من قائمة شريط الأدوات.

في الشاشة الأولى، يتم اختيار الطفرة Cysteine three to Syrian لتقييمها. وتُعرض البيانات الخاصة بهذه الطفرة جنبًا إلى جنب مع تشغيل العينة الفارغة (blank run) التي أُجريت لهذه الطفرة؛ تابع ذلك بالنقر على Next. وتُظهر الشاشة التالية البيانات بعد طرح نتائج تشغيل العينة الفارغة من نتائج التشغيل الذي يحتوي على العينة.

اختر تقييم الحركية (kinetics) بالنقر فوق زر kinetics. الآن، اختر ملاءمة البيانات لنموذج تفاعل واحد لواحد (one-to-one interaction model). بالنقر فوق زر fit، ستظهر عملية الملاءمة على الشاشة تزامناً مع حسابها.

بمجرد أن يصبح جاهزاً، يتم تطبيق ضوابط الجودة تلقائياً وإبرازها في الأسفل. راجع بنود ضوابط الجودة ثم افحص بيانات مخطط الاستشعار (sensor gram) للتأكد من أن المخططات تظهر انحناءً كافياً. اطلع أيضاً على مخطط البواقي الذي يوضح الفروق بين البيانات التي تم جمعها والنموذج المطبق.

انتبه إلى الانحرافات المنهجية وغير العشوائية. هذا التوافق مقبول. الآن، ألقِ نظرة على البيانات الحركية في علامة تبويب التقرير.

ثابت معدل الارتباط، وثابت معدل التفكك، وثابت تفكك التوازن. عند الانتهاء، اضغط على إنهاء وكرر الإجراء نفسه لجميع الطفرات الأخرى. فيما يلي النتائج الممثلة لتحليل CFCA لمختلف متغيرات cystatin B التي تم فحصها.

يتم استخراج بيانات تركيز الارتباط النوعي من الرسوم البيانية للمستشعر التي تم الحصول عليها عند معدلات تدفق تبلغ 10 و100 ميكرولتر في الدقيقة. وعند مقارنة التركيز المحدد بواسطة قياس 80 مرتين مع التركيز المحدد بواسطة CFCA، يتضح أنه بينما يكون البروتين نشطاً تماماً في معظم الحالات لمتغير leucine 73 glycine، فإن جزء البروتين النشط يكون منخفضاً جداً. كما يتم تحديد حركية ارتباط متغيرات cystatin B بـ pepin باستخدام حركية الدورة الواحدة.

تُظهر الرسوم البيانية للمستشعر البيانات بعد طرح قيم الفراغ والمرجع، مع تراكب المنحنى الحركي لنموذج تفاعل واحد لواحد باللون الأسود. يبلغ تركيز الارتباط النوعي الذي تم قياسه بواسطة CFCA للمتغير leucine 73 حوالي 10% فقط من إجمالي تركيز البروتين كما تم تحديده بواسطة قياس two 80. وعند استخدام التركيز الصحيح في حساب المعاملات الحركية، يتضح أن معدل الارتباط لـ Lucien 73 مشابه لمعدل الارتباط في المتغيرات الأخرى.

بينما تكون معدلات الارتباط للطفرات مشابهة لتلك الخاصة ببروتين النوع البري، فإن ثابت معدل التفكك للطفرات يمكن أن يكون أعلى بنحو مرتبتين عشريتين مع زيادة مقابلة في ثابت التفكك عند التوازن. ويعتمد انخفاض التقاربات بشكل أساسي على زيادة معدلات التفكك، مما يشير إلى أن كلاً من حلقة الارتباط الثانية والنهاية الطرفية C لبروتين cystatin B تساهمان في تقارب الارتباط من خلال إبقاء المثبط مرتبطاً بالإنزيم بمجرد تشكل المعقد. لقد كان استخدام تحليل التركيز الخالي من المعايرة أساسياً للوصول إلى هذا الاستنتاج لأن إحدى الطفرات تبين أنها تمتلك نشاط ارتباط منخفضاً جداً. لقد أوضح لك زميلي Pol الآن كيفية استخدام bi core X 100 في دراسة وظيفية منظمة. وعند إجراء هذه التجارب، من المهم تذكر أنه على الرغم من أن كلاً من تحليل التركيز والتحليل الحركي يستندان إلى نفس إجراء الارتباط، إلا أن الظروف التجريبية تختلف تماماً.