تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

لبدء هذا البروتوكول، اختر ناقلاً للتعبير عن المؤثر البكتيري المفضل لديك. في الخميرة وسلالة الخميرة، يتم بعد ذلك تحويل الناقل إلى خلايا الخميرة. ثم يتم تحفيز التعبير عن المؤثر.

يتم تحلل الخلايا المُحفزة لإجراء تحليل western blot لاحقًا للتحقق من تعبير البروتين المؤثر. وبعد تأكيد تعبير البروتين المؤثر، تُنمى الخلايا وتوضع تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف على أوساط نمو كابتة ومحفزة. وأخيرًا، بعد يومين إلى ثلاثة أيام، يتم تحليل نمو الخميرة.

مرحباً، أنا دو سولومون من مختبر الدكتور غويدو سيسا في قسم علوم النبات بجامعة تل أبيب. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحديد أنماط تثبيط النمو الناتجة عن التعبير عن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث في الخميرة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة وظيفة المؤثرات من النوع الثالث في البكتيريا الممرضة سالبة الجرام، وهو أداة تساعدنا في تحديد أهداف المؤثرات TIC.

لنبدأ الآن. هناك عدة عوامل مهمة يجب مراعاتها وتحسينها عند تصميم نظام خميرة مناسب للتعبير عن المؤثرات من النوع الثالث محل الدراسة. العامل الأول هو المحفز الذي يقود عملية التعبير عن هذه المؤثرات.

بما أن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث قد تكون سامة لخلايا الخميرة، فيجب استخدام محفز قابل للاستحثاث للتحكم في تعبيرها. سنستخدم محفز GAL 1 في هذه التجربة. أما العامل الثاني فهو عدد نسخ جين المؤثر.

يتم تحقيق مستويات تعبير عالية عندما يُحمل الجين المؤثر بواسطة بلازميد ميكرونين. ويتم الحصول على تعبير متوسط باستخدام بلازميد يحتوي على سنترومير، بينما يتحقق التعبير المنخفض عندما يُدمج الجين المؤثر في جينوم الخميرة عن طريق إعادة الاندماج المتماثل. أما العامل الثالث الذي يجب مراعاته فهو وسم الإيبيتوب المستخدم للتحقق من التعبير البروتيني في الحالات التي لا تتوفر فيها أجسام مضادة ضد المؤثر المعني.

تُستخدم عادةً وسوم مثل M hemagglutinin HA أو flag، والتي تتوفر لها أجسام مضادة تجارية موثوقة. ونقترح استخدام نسخة واحدة فقط من الوسم لتقليل التأثيرات الضارة غير المرغوب فيها على بنية ونشاط البروتين المؤثر. وأخيرًا، يجب أن تكون سلالة الخميرة المستخدمة للتعبير حساسة للمؤشر الانتقائي لناقل التعبير.

لإنماء خلايا الخميرة من أجل عملية التحول، اختر مستعمرة خميرة من طبق حديث وعقم ثلاثة ملي لتر من وسط YPD في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملي لتر باستخدام جهاز vortex. ضع أنبوب المزرعة لفترة وجيزة في جهاز الدرفلة (roller) واحضنه طوال الليل عند 30 درجة Celsius مع التدوير المستمر. وفي صباح اليوم التالي، أخرج المزرعة من جهاز الدرفلة وقم بإجراء الطرد المركزي عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي تماماً وأعد تعليق الخلايا في 1 milliliter من منظم تعليق Resus، مع الخلط باستخدام جهاز vortex بالسرعة القصوى لمدة 10 seconds تقريباً. لكل بلازميد سيتم تحويله، ولعملية تحويل ضابطة إضافية، انقل 100 microliters من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 5 microliters من DNA السperm الخاص بسلمون salmon أحادي السلسلة، و 250 إلى 500 nanograms من DNA البلازميد إلى كل أنبوب باستثناء الأنبوب الضابط.

بعد ذلك، أضف بعناية 650 µL من محلول التحول إلى كل أنبوب وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس. حضّن الأنابيب عند درجة حرارة 30 °C لمدة 30 دقيقة على جهاز تدوير الأنابيب. عند اكتمال فترة التحضين، أضف 70 µL من DMSO إلى كل أنبوب واخلط عن طريق قلب الأنابيب من 10 إلى 15 مرة لتجنب تكسير الخلايا.

لا تقم برج الأنابيب باستخدام جهاز الـ vortex. ضع الأنابيب في حمام مائي مُدفأ مسبقاً عند درجة حرارة 42 degree Celsius واتركها للحضن لمدة 15 minutes. بعد مرور 15 minutes، أخرج الأنابيب من الحمام المائي وضعها على الفور في الثلج لمدة دقيقتين.

بمجرد أن تبرد الأنابيب، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم تُستخدم الماصة لإزالة الطافي اللزج بعناية. يُعاد تعليق كل راسب في 150 microliters من الماء المقطر المزدوج المعقم، ويتم نشر معلق الخلايا على طبق يحتوي على الوسط الانتقائي المناسب. تُترك الأطباق مفتوحة لمدة دقيقتين وتُترك لتجف داخل غطاء التدفق الصفائحي.

بعد ذلك، ضع الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة تتراوح من يومين إلى ثلاثة أيام لتنمية خلايا الخميرة. ولتحضير مستخلص بروتيني، قم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من الوسط الكابت المناسب بمستعمرة خميرة من طبق حديث وتعريضها للرج بواسطة جهاز الفورتيكس. وفي اليوم التالي، ضع أنبوب المزرعة لفترة وجيزة في جهاز الدوران (roller) عند درجة حرارة 30 درجة مئوية.

أخرج المزرعة من جهاز التدوير وقم بطردها مركزياً عند 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من الراشح وأعد تعليق كتلة الخلايا. في 3 mL من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم، اخلط المزيج بواسطة جهاز الفورتكس ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى، تخلص من الراشح وأعد تعليق الخلايا في 3 mL من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم. الآن، انقل 200 µL من معلق الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 15 mL يحتوي على 3 mL من وسط التحريض المناسب، واخلطه بواسطة جهاز الفورتكس.

ضع الأنبوب في جهاز تدوير (roller) وحضنه طوال الليل عند 30 درجة Celsius. وفي صباح اليوم التالي، انقل 1 mL من المزرعة، أو كمية أكبر في حال كانت المزارع منخفضة الكثافة، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (micro centrifuge tube). اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 800 Gs لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ومن هذه النقطة فصاعداً، اعمل داخل خزانة استخلاص الأدخنة (fume hood) لتجنب استنشاق أبخرة Beamer capto ethanol السامة.

قم بإزالة السائل الطافي بعناية باستخدام الماصة وأعد تعليق كتلة الخلايا في 100 µL من محلول التحلل المبرد على الثلج. اخلط المزيج بقوة باستخدام جهاز الرج (vortexing) واتركه في الحضانة على الثلج لمدة 30 دقيقة. وخلال فترة الحضانة التي تستغرق 30 دقيقة، حدد حجم حمض الهيدروكلوريك العادي بتركيز ستة المطلوب لمعايرة 100 µL من محلول التحلل المنظم لتصل قيمة pH من تسعة إلى 10.

للقيام بذلك، أضف أحجاماً مختلفة من حمض الهيدروكلوريك إلى 100 µL من محلول التحلل (lysis buffer) في 10 أنابيب مختلفة، وتحقق من pH المحلول باستخدام شريط كشف pH في نهاية فترة الحضانة عند إضافة الحجم المناسب من حمض الهيدروكلوريك إلى المستخلص، ثم اخلطه باستخدام جهاز الفورتكس (vortexing). بعد ذلك، أضف 50 µL من محلول عينة تركيز 3x (three x sample buffer) إلى المستخلص واخلطه بواسطة جهاز الفورتكس، ثم اصنع ثقباً في غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق (micro fuge tube) باستخدام إبرة، وقم بغلي محلول المستخلص على كتلة تسخين (heating block) لمدة خمس دقائق. بعد الغليان، اترك المحلول ليبرد لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم برج محلول التحلل باستخدام جهاز الـ vortex وطرده مركزياً لمدة 10 ثوانٍ. أصبح محلول التحلل الآن جاهزاً للتحليل المناعي للدم لتجهيز الخلايا لاختبار التنقيط. قم بزراعة مستنبتات بحجم ثلاثة ملليلتر من كل سلالة كما تم توضيحه سابقاً في اليوم التالي.

قم بتحضير طبقين يحتويان على وسط اصطناعي كامل خالي من الليوسين. يجب تدعيم وسط أحد الطبقين بـ 2%glucose، والطبق الآخر بـ 2%actose و 1%raffinose. جفف الأطباق في غطاء تدفق صفائحي معقم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

احصد الخلايا وأعد تعليق كل كتلة خلوية في ثلاثة ملي لترات من الماء المقطر المزدوج (DDW) المعقم. كرر خطوة الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا مرة أخرى في ثلاثة ملي لترات من الماء المقطر المزدوج المعقم. حدد الكثافة الضوئية أو OD لكل مزرعة، ثم قم بتحضير معلقات خلوية بحجم واحد ملي لتر وبكثافة ضوئية OD 600 تساوي واحد في أنابيب ميكروفيش معقمة.

بعد ذلك، قم بتحضير ثلاثة تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف من كل معلق خلوي باستخدام ثلاثة أنابيب دقيقة معقمة تحتوي على 900 µL من الماء المقطر المعقم (DDW). ضع الأطباق الجافة على شبكة، وبالنسبة لكل مزرعة، ضع 10 µL من التخفيفات الأربعة في صف واحد. بعد عملية التنقيط، اترك الأطباق مفتوحة داخل كابينة السلامة البيولوجية لعدة دقائق.

عندما تجف البقع، قم بتغطية الأطباق ووضعها في حاضنة عند درجة حرارة 30 degree Celsius لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. سنعرض الآن نتائج اختبار تنقيط الخميرة للكشف عن تثبيط النمو. الأنماط الظاهرية المستحثة عن طريق التعبير عن مؤثرات النوع الثالث هنا، وهي مؤثرات النوع الثالث A-V-R-P-T-O hop و AA one one و AAV RE one الخاصة بالبكتيريا.

تم التعبير عن بروتينات Pseudomonas Riner الممرضة للطماطم من بلازميد يحتوي على سنتريومير في سلالة خميرة على وسط كابت؛ حيث أظهرت سلالات الخميرة التي تحمل بلازميدات التعبير عن A-V-R-P-T-O و HOP AA one one نمواً مشابهاً لسلالة التحكم التي تحتوي على ناقل فارغ. وبينما أظهرت الخميرة التي تحمل AAV RE one انخفاضاً طفيفاً في النمو، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تسرب محفز GAL one والسمية الخلوية العالية لـ AV RE one، فإن التعبير عن AV E one أو HOP AA one one تحت ظروف التحفيز أدى إلى نمط تثبيط نمو شديد انعكس في غياب المستعمرات في جميع التخفيفات. وفي المقابل، لم يؤدِّ التعبير عن A-V-R-P-T-O إلى أي تأثير مثبط للنمو.

لقد عرضنا للتو كيفية تحديد أنماط تثبيط النمو الناتجة عن التعبير عن المؤثرات البكتيرية من النوع الثالث في الخميرة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اختيار ناقل التعبير وهذه السلالة بعناية، حيث يمكن لكليهما التأثير بشكل كبير على النتائج. بالإضافة إلى ذلك، تذكر استخدام هذه المستعمرات المحولة حديثاً في جميع خطوات الإجراء.

هذا كل شيء. شكراً لكم على المشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.