تقييم ميزات التعليم العالي ذات الصلة مناعيا الديناميكية الهيكلية للHIV - 1 حلقة V3 تسلسل R2 بواسطة ولي العهد منذ البداية للطي

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم التفضيلات البنيوية الديناميكية لتسلسل ببتيد تاج V3 لسلالة R2 من فيروس HIV عبر طي AR، وربط النتائج بحساسيات التعادل المعروفة لسلالة R2. ويتم تحقيق ذلك من خلال اختيار جزء مناسب من تاج حلقة V3 لسلالة R2 لطي AR bonni. وكخطوة ثانية، يتم إجراء محاكاة للطي، والتي تبحث في جميع التشكيلات الممكنة لجزء تاج R2 وتسجل التشكيلات الأكثر احتمالاً في ملف مكدس (stack file).

بعد ذلك، يتم تحليل التشكيلات المسجلة لتحديد التفضيل الهيكلي الديناميكي لتاج R two V three الذي قد يفسر حساسيته للتعادل. تظهر النتائج وجود تفضيل لموضع شريط بيتا صلب من 12 إلى 14 في عروة V three بناءً على البنية الثانوية، والتفضيل، وتوزيع الطاقة لمجموعة التشكيلات التي تم البحث عنها. مرحباً، أنا تيموثي كاردوزو، أتحدث إليكم من مختبري في قسم علم الأدوية بكلية الطب في جامعة نيويورك.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لطي البروتين المختبري (in vitro) لحلقة مرنة على بروتين فيروسي مناعي من فيروس HIV-1 يُعرف باسم GP120. تُعرف هذه الحلقة المرنة بحلقة V3 في البروتين السكري الغلافي السطحي لفيروس HIV-1، ويُعرف طرفها بتاج حلقة V3. هذه هي المنطقة التي سنقوم بطيها.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لمساعدتنا في تحديد المسارات المثمرة نحو تصميمات ناجحة للقاح HIV. لذا، دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء، حدد تسلسل V3 crown المراد طيه silico.

تشير الدراسات السابقة من هذا المختبر إلى أن المواضع من 10 إلى 22 في أي تسلسل للحلقة V3 تعطي أفضل النتائج؛ لذا قم بتشغيل تجارب طي armenio باستخدام القوائم المنسدلة سهلة الاستخدام في واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لبرنامج النمذجة الجزيئية ICM Pro. أولاً، يجب بناء البنية الذرية ثلاثية الأبعاد للببتيد المقابل لهذا التسلسل في الفضاء الافتراضي للحاسوب. ولبناء البنية الذرية ثلاثية الأبعاد، انتقل إلى قائمة file واختر new.

سيظهر لك شاشة تحتوي على عدة تبويبات. اختر تبويب الببتيد (peptide) ثم قم بلصق أو كتابة التسلسل في مربع النص. انقر موافق لبناء التركيب ثلاثي الأبعاد للببتيد.

سيظهر التركيب في النافذة الرسومية لبرنامج ICM. وبمجرد بناء التركيب ثلاثي الأبعاد، انتقل إلى قائمة الميكانيكا الجزيئية واختر "minimize"، والتي ستظهر كقائمة جانبية. من القائمة الجانبية، اختر "global".

ستظهر شاشة تحتوي على عدة حقول إدخال ومربعات اختيار محددة مسبقاً وفقاً للمعايير الافتراضية. قم بتغيير الاختيار عند الضرورة لتحديد الببتيد المراد طيه. كما يمكنك ضبط طول ودقة المحاكاة عن طريق تغيير عدد الحركات العامة (global moves) وعدد استدعاءات التقليل المحلي (local min calls) على التوالي.

اختر "all" لطي جميع ذرات الببتيد. ثم اختر "save movie" لإنشاء ملف فيديو لعملية الطي. وأخيراً، انقر فوق "apply" لبدء عملية الطي في النافذة الرسومية.

يبدأ الخوارزمي في طي الببتيد إلى تشكيلات مختلفة، مع حساب وتسجيل طاقة الببتيد لكل تشكيل. وبمجرد الاكتمال، سيتم تحديد وتصور التشكيل الأكثر استقراراً من الناحية الطاقية للببتيد، بالإضافة إلى التشكيلات البديلة ذات الطاقة المتقاربة، على جهاز الكمبيوتر أثناء إجراء عملية طي الببتيد. يوضح استخدام الواجهة الرسومية شكل عملية الطي، ولكنه لا يسمح بالاختيار المثالي للمعاملات لطي عروة V3 crown.

لهذا الغرض، من الأفضل إجراء عملية الطي من سطر الأوامر غير الرسومي باستخدام نص برمجي (script). والنص البرمجي هو ببساطة سلسلة من الأوامر النصية المحفوظة سطرًا بسطر في مستند أو ملف نصي، يتم تغذيتها في برنامج ICM تلقائيًا وتنفيذها واحدًا تلو الآخر لطي الحلقة V3 باستخدام نص برمجي من أسطر الأوامر. أولاً، اكتب ملفًا نصيًا ليتم حفظه على القرص الصلب للكمبيوتر في دليل محلي. وكما سبق، ابدأ ببناء الببتيد في الفضاء الافتراضي للكمبيوتر.

بعد ذلك، قم بتسمية المحاكاة وتحديد عدد المتغيرات الحرة، وهي الروابط الكيميائية في الببتيد التي تظل حرة في الدوران أثناء عملية الطي. بعد ذلك، حدد مدة تشغيل المحاكاة لتحقيق الطي الأمثل للعروة V3. سيعتمد ذلك على عدد المتغيرات الحرة المحددة في الخطوة السابقة؛ ولتحديد دقة البحث التشكلي في التجربة، قم بتعيين عدد خطوات البحث التي سيتم تنفيذها في كل حد أدنى محلي.

بعد ذلك، قم بتعيين المعلمات الأخرى التي تم تحسينها للمحاكاة بناءً على أبحاث سابقة، بما في ذلك تقليل درجة الحرارة، والمنحدر، وتوزيع الاحتمالات. بعد تعيين المعلمات التجريبية، حدد حسابات الطاقة التي سيتم استخدامها أثناء عملية الطي. هنا، يُشار إلى طاقة Vander Vi بواسطة VW internal peptide.

يُشار إلى الطاقة بـ 14، وإلى طاقة الروابط الهيدروجينية بـ HB، والطاقة الكهروستاتيكية بـ El، وطاقة التمليح بـ SF، والإنتروبيا بـ EN. حدد الإعدادات النهائية، بما في ذلك زوايا الهيكل الأساسي والسلاسل الجانبية المفضلة للبحث عنها، والتشكيل الابتدائي.

أخيراً، اكتب الأمر الخاص بتشغيل الحساب وحفظه. بمجرد كتابة السكريبت وحفظه كملف نصي، قم بتشغيله من موجه أوامر نظام تشغيل الكمبيوتر. وكما سبق، سيتم تحديد التشكيل الأكثر استقراراً من الناحية الطاقية للببتيد، بالإضافة إلى التشكيلات البديلة ذات الطاقة المماثلة، وحفظها في ملف المشروع لعرضها بصرياً على الكمبيوتر.

بمجرد اكتمال الحساب، افتح الملف عن طريق اختيار "فتح الملف" (file open) من القائمة المنسدلة لبرنامج EE. قم بعرض الجزيء من خلال النقر فوق مربع الاختيار المجاور له في لوحة مساحة العمل، ثم اختر عرض مكدس الميكانيكا الجزيئية (molecular mechanics stack view). لعرض المكدس المرتب حسب الطاقة لأفضل تشكيلات الببتيد الناتجة عن عملية الطي، انقر فوق أداة الرسم البياني في الزاوية السفلية اليمنى من لوحة المكدس لرسم النتائج.

أولاً، انقر موافق في النافذة الناتجة، ثم انقر على التبويب الأوسط في المخطط المسمى best confo. بعد ذلك، انقر على الصف الأول من جدول نتائج المكدس، وهو الذي يمثل التشكل ذو الطاقة الأدنى الذي تم العثور عليه أثناء البحث. سيعيد هيكل الببتيد ترتيب نفسه ليأخذ تشكله ذو الطاقة الأدنى في النافذة الرسومية.

حلل هذا التشكيل للتحقق من وجود خصائص تشبه شريط بيتا (beta strand) أو لولب ألفا (alpha helical)، خاصة في المواضع الخمسة الأولى من الببتيد. يتم ذلك عن طريق تحديد هذه المنطقة في التسلسل والنقر على أيقونة العصا في أعلى يسار الشاشة لعرض جميع الذرات. بعد ذلك، يجب تحليل مجموعة نتائج الطاقة لرسم أفضل التشكيلات.

إذا كانت البنية ذات الطاقة الأدنى مفصولة بفجوة كبيرة عن البنى الأخرى، فإن ذلك يشير إلى ميل نحو بنية صلبة. ولتقييم النتائج، افتح قارورة المشروع واختر عرض تكدس الميكانيكا الجزيئية، حيث سيظهر جدول لبنى التكدس. قم بتصور بنى التكدس من خلال النقر على أيقونة المخطط التكراري.

أخيراً، انقر فوق تشغيل مكدس الميكانيكا الجزيئية لإنشاء فيلم للمكدس وتصور التفضيلات التشكيلية التي كشف عنها الطي هنا. تظهر النتائج الخاصة بطي R two. إن التشكيل ليس لولبياً من نوع alpha بل هو ملف عشوائي كما هو متوقع لتيجان الحلقة V three، لا سيما في الجزء الممتد من البقية 12 إلى 14.

في الحلقة V3، يظهر تفضيل تشكيلي واضح لسلاسل بيتا في جميع أنحاء المكدس، بينما لوحظت تشكيلات لولبية ألفا قليلة جداً. ويمكن التعرف على تشكيل سلسلة بيتا المحلية من خلال شكلها الخطي الممتد. وهذا هو موقع تتابع "إيزولوسين-برولين-ميثيونين" غير المعتاد في سلالة R2، وهو تتابع نادر في سلالات HIV في هذا الموضع، ويُفترض أنه المسؤول عن السمات غير المعتادة لسلالة R2.

علاوة على ذلك، تُلاحظ فجوة طاقة تبلغ ثلاث وحدات تقريباً بين التشكيل ذو الطاقة الأدنى والتشكيل ثاني أدنى طاقة. وبالتالي، فإن البنية لا تخرج عن التشكيل ذو الطاقة الأدنى بنسبة أقل من 1% من الوقت، مما يشير إلى أن تاج R two V three وتشكيل beta strain المحلي في المواضع من 12 إلى 14 يتميز ببنية أكثر صلابة بدلاً من كونها مرنة تماماً بطبيعتها. لقد عرضنا لكم للتو كيفية طي تسلسل تاج V three loop باستخدام خوارزمية abio المطبقة في برنامج ICM، وكيفية تحليل النتائج باستخدام سلالة R two لفيروس HIV.

على سبيل المثال، عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم اختيار هوية الببتيد المطوي المقابل لجزء من الـ V three crown بعناية، ومن المهم أيضاً تفسير النتائج فيما يتعلق بالتفضيل التشكلي والطاقة من خلال استشارة خبير في النمذجة الجزيئية. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.