Transnuclear الفئران مع الخصوصيات المحددة مسبقا ضد مستقبلات الخلايا T المقوسة الغوندية الحصول عليها عن طريق SCNT

لقد كانت الفئران المعدلة وراثياً بمستقبلات خلايا T النوعية للمستضد لا غنى عنها في دراسة تطور خلايا T ووظيفتها، وذلك لإنشاء نماذج فئران ذات نوعيات محددة مسبقاً لمستقبلات خلايا T باستخدام تقنية نقل نوى الخلايا الجسدية (SCNT). يتم إصابة الفأر بمسبب مرض معين، ثم تُعزل خلايا T من الفأر وتُنقى بعد ذلك عن طريق فرز الخلايا المنشط فلورياً.

تُستخدم الخلايا التائية المنقاة بعد ذلك في عملية نقل نوى الخلايا الجسدية. وبعد أن تصل الأجنة إلى مرحلة الكيسة الأرومية، يتم عزل الخلايا الجذعية الجنينية. ثم تُحقن هذه الخلايا في الكيسات الأرومية، والتي تُنقل بدورها إلى فئران حامل كاذبة.

تُظهر الجراء الناتجة زيادة ملحوظة في تعداد الخلايا التائية المستهدفة، وهو ما يمكن التحقق منه عبر تحليل PAX. مرحباً، اسمي Okta AK، وأنا باحثة في مرحلة ما بعد الدكتوراه هنا في معهد White للأبحاث الطبية الحيوية. سأوضح لكم اليوم كيفية إجراء حقن المساعدة في تفجير نقل CLE الجسدي بالإضافة إلى نقل الأجنة.

تكمن الميزة الرئيسية للنقل الجسدي في إمكانية إنشاء نماذج فئران تعبّر عن مستقبلات الخلايا التائية الخاصة بها من الموقع الداخلي، وبالتالي تكون تحت تحكم المروج الداخلي، بالإضافة إلى إمكانية إنتاج هذه النماذج بسرعة كبيرة. ويمكن استخدام النقل السائل الجسدي كأداة لإنشاء نماذج فئران ذات خصوصيات محددة مسبقاً لمستقبلات الخلايا التائية أو مستقبلات الخلايا البائية. وهذا الأمر يكتسي أهمية خاصة للعاملين في مجالات مثل المناعة الذاتية، والأمراض المعدية، والسرطان.

لعزل الخلايا التائية النوعية لممرض مثل Toxoplasma gondii، يتم حقن الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق، وعند ذروة الاستجابة المناعية، يُستخلص الطحال من الفأر الذي تم القتل الرحيم له، ثم تُعزل الخلايا المانحة المتجانسة وتُحضن مع أجسام مضادة معلمة بالفلورسنت والتتramer المناسب. وأخيراً، يتم إجراء الفرز الخلوي للحصول على الخلايا التائية النوعية للممرض. في المساء السابق لإجراء إزالة نواة البويضة.

قم بتجهيز إبر حقن بيسو (piso) بمقاسات أربعة وخمسة وسبعة ميكرومتر باستخدام حقنة لتحميلها بالزئبق بطريقة عكسية. وفي اليوم التالي، ابدأ بروتوكول نقل نواة الخلية الجسدية عن طريق جمع البويضات، ثم نقلها باستخدام ماصة فموية إلى قطرات من وسط K-S-O-M-A-A في طبق بتري. وفي غطاء طبق بتري.

قم بتجهيز طبق لإجراء عملية نقل نواة الخلية الجسدية أو SCNT عن طريق وضع حوالي 10 قطرات من PVP، وحوالي 10 قطرات من HCZB الذي يحتوي على 5 µg/mL من cyto B، وحوالي 10 قطرات من HCCB الذي يحتوي على 2.5 µg/mL من cyto B. سيُشار إلى هذا الطبق باسم طبق S-C-N-T-A. ضع طبق S-C-N-T-A على منصة مجهر مركب مقلوب.

بعد ذلك، ضع إبرة استئصال النواة بقطر 7 µm في المجهر الدقيق وقم بغسلها عن طريق السحب في محلول PVP للتخلص منه من 5 إلى 10 مرات. ثم انقل من 10 إلى 30 بويضة متوقفة في الطور الاستوائي من طبق بتري إلى إحدى قطرات HCCB التي تحتوي على 5 µg/mL من Cyto B على لوحة S-C-N-T-A، واحضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وخلال فترة الحضن، قم بمحاذاة البويضات أفقيًا.

بعد مرور خمس دقائق، استخدم إبرة الاستئصال لوضع البويضة أمام إبرة التثبيت. وباستخدام حاقن دقيق، طبق تفريغاً هوائياً لتثبيت البويضة في إبرة التثبيت ذات الماصة الدقيقة.

بعد ذلك، وباستخدام إبرة استخراج النواة، قم بتدوير البويضة حتى يصبح معقد المغزل الكروموسومي، الذي يظهر شديد الشفافية مقارنة بسيتوبلازم البويضة، في وضع الساعة الثالثة، ثم ابدأ نبضة pizo بالضغط على الدواسة لاختراق zno lucita. نبضة pizo هي نبضة ميكانيكية تنتقل طوليًا وتسبب اهتزاز طرف إبرة استخراج النواة، وتساعد هذه الاهتزازات الطرفية في الثقب عبر zop lucita.

بمجرد اختراق zona pellucida، ضع فتحة إبرة التنوي adjacent إلى مغزل الطور الاستوائي الثاني وقم بتطبيق الفراغ. سينتقل معقد المغزل الكروموسومي ببطء إلى داخل الإبرة. وبمجرد إزالة الإبرة، يجب أن ينغلق الغشاء تلقائياً.

أخيرًا، وباستخدام ماصة فموية، انقل الخلايا منزوعة النواة مرة أخرى إلى قطرات K-S-O-M-A-A. ثم باستخدام الماصة نفسها، اغسلها عن طريق نقلها من قطرة إلى أخرى من KSOM AA. ولإجراء عملية نقل النواة، استبدل إبرة نزع النواة ذات القطر 7 ميكرومتر الموجودة على الملاعب الدقيق (micro manipulator) بإبرة نقل نواة يتراوح قطرها بين 4 إلى 5 ميكرومتر. اغسل الإبرة باستخدام PVP كما سبق.

ضع الخلايا التائية الإيجابية CD8 التي تم عزلها مسبقاً في قطرة من PVP على لوحة S-C-N-D-A. امزج جيداً واحضن المزيج لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، انقل من 10 إلى 30 خلية منزوعة النواة (ENUCLEATED cytes) إلى قطرة من HCZB بتركيز 2.5 micrograms per milliliter.

يتم تحضين Cyto B على طبق S ct. A لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وخلال فترة التحضين، تُستخدم إبرة النقل النووي لمحاذاة الخلايا أفقياً باستخدام إبرة الحقن.

التقط خلية مانحة موجبة لـ CD8 من وسط PVP وقم بسحبها ودفعها إلى الخارج بشكل متكرر حتى يتم تفكيك الغشاء الخارجي. إذا لزم الأمر، قم بتطبيق نبضة pizo حيث يجب أن تصبح شظايا الغشاء والسيتوسول مرئية. اسحب النواة داخل الإبرة.

بعد ذلك، استمر في التقاط النوى حتى يتوفر من 10 إلى 30 نواة. ثم انتقل إلى القطرة التي تحتوي على الخلايا المفرغة من النواة والمصطفة. قم بتطبيق vacuum لتثبيت بويضة واحدة على إبرة التثبيت.

بعد ذلك، ضع إبرة النقل النووي NU بجانب zop lucita مع توجيه النوى بعيداً عن الفتحة. قم بتطبيق نبضة pizo حتى تخترق الإبرة zop lucita. حرك الميكرومانيبولاتور (micro manipulator) بعناية لنقل نواة واحدة إلى طرف الإبرة.

ادفع الإبرة داخل البويضة حتى يصل ثلثا طول رأس الإبرة إلى الداخل. قم بتطبيق ضغط سلبي بسيط بحيث يدخل جزء صغير من غشاء البويضة في الإبرة. الخطوة التالية بالغة الأهمية.

بما أن هذا هو الوقت الوحيد الذي تكون فيه البويضة مفتوحة بالفعل، قم بتطبيق نبضة ZO واحدة. ثم قم بتطبيق ضغط إيجابي لدفع النواة خارج الإبرة.

اسحب الإبرة بحذر بحيث يكون الطرف في حوالي ثلث المسافة داخل البويضة، ثم طبق ضغطاً سالباً واستمر في سحب الإبرة لإغلاق البويضة. كرر هذه الخطوة مع كل بويضة.

بعد أن تتلقى جميع البويضات النواة، انقلها إلى طبق بتري واغسلها عن طريق نقلها من قطرة إلى أخرى من وسط KS OM AA المحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد فترة التحضين، انقل أجنة SCN T إلى قطرات من وسط التنشيط الخالي من الكالسيوم والمحتوي على كلوريد السترونشيوم. يعمل كلوريد السترونشيوم على تنشيط البويضة عن طريق تحفيز تذبذبات الكالسيوم التي تحدث بشكل مماثل أثناء عملية الإخصاب.

يتم التحضين لمدة ست ساعات. وإذا رغبت في ذلك، أضف TSA، وهو مثبط غير نوعي لإنزيمات نزع أسيتيل الهيستون، إلى وسط التنشيط. وبغية تحسين الكفاءة بعد التنشيط، افحص الأجنة باستخدام المجهر المقلوب لتحديد عدد النويات الكاذبة أو أجنة SCNT الإيجابية لـ PPN. ويمكن تحديد PPN بناءً على مظهرها.

تبدو هذه كأنها بويضات. يتم غسلها واستزراعها بطريقة "sunny side up". تُترك الأجنة مع قطرات من K-S-O-M-A-A لمدة ثلاثة أيام ونصف عند 37 درجة Celsius حتى تصل إلى مرحلة البلاستوسيت (blastocyst stage).

في البداية، يجب عليك التركيز على تنفيذ الإجراءات التي عرضناها للتو بشكل صحيح فيما يتعلق بالتنوية والنقل النووي NU. وبمجرد إتقان هذه التقنيات، ستصبح الإجراءات التالية أسهل في الإدارة. أما الخلايا الجذعية الجنينية أو خلايا ES المستخدمة هنا، فقد تم اشتقاقها باستخدام تقنيات قياسية.

يجب تحضير هذه المواد في يوم الحقن بمساعدة الانفجار، بعد ثلاثة أيام ونصف من عملية الجماع. قم بتجهيز غطاء طبق بكتيري معقم عن طريق وضع قطرات تحتوي على PVP و HCZP. بعد ذلك، قم بتجهيز إبرة حقن بقياس 15 ميكرومتر لنبضة piso كما سبق.

بعد ذلك، ضع إبرة الحقن في المجهر المتلاعب (micro manipulator) واغسلها باستخدام PVP transfer. قم بإجراء من 10 إلى 30 من دفعات المساعدة (blast assists) في قطرة من HCZB. ثم ضع من 5 إلى 50 µL من معلق ESL في قطرة أخرى من HCZB.

يجب أن يكون عدد خلايا ES كافياً بحيث يمكن التقاطها بسهولة، ولكن دون أن تكون متزاحمة. بعد ذلك، يتم التقاط من 30 إلى 100 خلية ES باستخدام إبرة الحقن، ثم الانتقال إلى القطرة التي تحتوي على blast assist.

قم بمحاذاة أداة المساعدة في التفجير أفقياً وثبّتها باستخدام إبرة التثبيت عن طريق تطبيق الفراغ. استخدم إبرة الحقن لتدوير أداة المساعدة في التفجير حتى تصبح الكتلة الخلوية الداخلية عند موضع الساعة التاسعة. ضع إبرة الحقن عند موضع الساعة الثالثة.

تأكد من عدم وجود خلايا ES عند طرف الإبرة، وقم بتطبيق نبضة piso حتى تخترق إبرة الحقن عبر zop lucita و trifecta وصولاً إلى blastic seal. قم بتحرير من خمس إلى 15 خلية ES بحيث تلتصق بالكتلة الخلوية الداخلية. استمر في ذلك حتى يتم حقن جميع blast assist بعد انتهاء عمليات الحقن.

تُغسل مرتين في محلول K-S-O-M-A-A ثم يتم البدء في نقل الأجنة جراحياً إلى إناث حاملات كاذب؛ ضع الفأرة المستقبلة الحاملة كاذب والمخدرة في منطقة الجراحة. وباستخدام ماكينة حلاقة كهربائية، قم بإزالة الشعر من الربع السفلي الأيمن. عقم المنطقة باستخدام محلول يعتمد على اليود وإيثانول 70% تحت مجهر تشريحي.

استخدم المقص لفتح الجلد، ثم ضع المقص وهو مغلق بين الجلد والبريتون وافتحه لفصل البريتون عن الجلد. حدد موقع المبيض من خلال البريتون، والذي يجب أن يظهر كنقطة حمراء. بعد ذلك، استخدم المقص لفتح البريتون في تلك المنطقة.

استخدم الملقط للإمساك بعناية بالـ UCT أو الدهون المحيطة بها واسحب الرحم باستخدام أنبوبة شعرية متصلة بماصة فموية. اجمع مجموعة تتكون من حوالي 10 من الـ blast assists مع تثبيت قناة فالوب والرحم بواسطة الملقط. استخدم إبرة لعمل ثقب صغير في الرحم.

ثم أدخل الشعيرة المزودة بمساعد التفجير في تجويف الرحم وحررها. ادفع الرحم مرة أخرى إلى التجويف البطني. حدد حواف الصفاق وأغلقها ببضع غرز.

أغلق جلد الفأر باستخدام بعض الدبابيس الجراحية. قم بإعطاء مسكن للألم عن طريق الحقن تحت الجلد. ثم انقل الفأر مرة أخرى إلى قفصه تحت مصباح تدفئة.

راقب تنفس الفأر حتى يستيقظ. بعد عملية استئصال النواة ونقل نواة الخلية الجسدية، كانت حوالي 70% من الأجنة إيجابية للنوى الكاذبة.

كما هو موضح في هذا الشكل، لم يكن للعلاج بـ TSA لمدة ست أو 10 ساعات أي تأثير. وبعد ثلاثة أيام ونصف من الزرع، تطورت نسبة 5 إلى 10% من الأجنة إلى بلاستوسيت.

ومرة أخرى، لم يكن لإضافة TSA أي تأثير على معدل تطور البلاستوسيت. بعد ذلك، استُخدمت البلاستوسيت الناتجة عن SCNT لاشتقاق خلايا جذعية جنينية. وقد أدت TSA إلى تحسين المعدل الذي اشتُقت به ESL من البلاستوسيت بشكل ملحوظ.

تُستخدم خلايا S-C-N-T-E-S لتوليد فئران خيمرية. يتم سحب الدم من هذه الفئران وتحليله للكشف عن وجود خلايا T محددة باستخدام تحليل الحقائق كما هو موضح هنا. وعند صبغ الدم باستخدام جسم مضاد لـ CDA وتيترايمر محدد، يمكن تحديد مجموعة ذات إيجابية مزدوجة.

مما يشير إلى أن الخلية المانحة المستخدمة في عملية SCNT كانت ذات نوعية صحيحة. لقد أوضحت لكم للتو كيفية إجراء نقل LU للخلايا الجسدية، وحقن المساعدة في blast، ونقل الأجنة. إن النقطة الأكثر أهمية التي يجب مراعاتها هي نقاء الخلايا التائية (T-cell) أو الخلايا البائية (B cells) لديكم.

بمجرد تعلم كيفية إجراء النقل الجسدي ووصول أجنّتك إلى مرحلة البلاستولة، يمكنك الاختيار بين نقلها مباشرة إلى إناث حاملات كاذبة أو استخدامها لاشتقاق خلايا جذعية جنينية وتوليد فئران خيمرية.