مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الربط بين أخذ العينات من المنتجات الطازجة باستخدام الشريط اللاصق وبين الكشف الجزيئي عن الخلايا الكاملة لأنواع الـ salmonella باستخدام تقنية التهجين الفلوري السريع في الموقع، المعروفة أيضاً باسم FISH. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وضع شريط لاصق على المادة المطلوبة واستخلاص الخلايا المرتبطة بالسطح. ويمكن تحليل الأشرطة المحملة بالخلايا مباشرة أو إخضاعها لعمليات إثراء في الطور الصلب أو السائل.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في التثبيت الذاتي على الشريط وإزالة الماء باستخدام سلسلة من الإيثانول للخلايا الملقحة في المرق أو المخصبة فيه. وتتضمن الخطوة الثانية تثبيت الخلايا في المعلق، يليه إعادة تعليق الخلايا في محلول التخزين المنظم. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي إجراء خطوة تهجين سريعة على الشريط باستخدام خليط من مجسات قليلة النيوكليوتيد النوعية لبكتيريا salmonella، يليه إزالة المجسات الزائدة عن طريق الشطف بمحلول غسيل منظم؛ وبالنسبة للعينات التي يتم تحليلها عبر تقنية fax، يتم تنفيذ خطوة fish في المعلق، ويمكن إزالة المجسات الزائدة باستخدام خطوة تخفيف بسيطة قبل التحليل.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في صبغ الخلايا المرتبطة بالشريط والمُهجنة صبغاً تباينياً باستخدام DPI وفحصها باستخدام المجهر الفلوري. وبالنسبة للتحليلات القائمة على الحقائق، لا يلزم استخدام صبغ تبايني. وفي الختام، توفر هذه الطريقة وسيلة للكشف البصري أو القياس الخلوي عن أنواع السالمونيلا التي قد تكون موجودة في المنتجات الطازجة التي تم أخذ عينات منها.

خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة أثناء قراءتي عن مجموعة إيطالية كانت تستخدم نهجاً مشابهاً لفحص المجتمعات البكتيرية على آثار الحجر الجيري الروماني. وقد قدتُ أنا و r نقاشاً حول هذا العمل في صف كنت أدرسه حول الطرق السريعة في ميكروبيولوجيا الأغذية. وبعد بضعة أسابيع، بدأ تفشي لبكتيريا salmonella تتبع مصدره إلى المنتجات الطازجة، مما أدى في النهاية إلى إصابة ما يقرب من 1500 شخص في 43 ولاية مختلفة.

بينما يوفر نهجنا التجريبي وسيلة عملية وفي الوقت المناسب للكشف عن أنواع بكتيرية محددة في المنتجات الطازجة، إلا أنه يتميز أيضاً بقابلية النقل التي تتيح إجراء الاختبارات في الميدان أو في بيئة إنتاج الغذاء. ابدأ باختيار شريط لاستخدامه في أخذ العينات؛ وتشمل بعض الخيارات أشرطة الفطريات المتاحة تجارياً أو أشرطة التلامس، وهي معقمة ومعبأة لتسهيل الاستخدام.

باستخدام قلم تحديد دائم، ارسم مربعات بطول سنتيمتر واحد على الجانب غير اللاصق لقطعة من الشريط اللاصق بطول 10 سنتيمتر باستخدام قالب من الألومنيوم المعقم. سيعمل ذلك كدليل بصري لتحديد الجزء من الشريط الذي تم استخدامه لأخذ عينة من الغذاء أو السطح البيئي. شكل حلقة من الشريط على شكل حرف C بحيث يكون الجانب اللاصق مواجهاً للسطح المراد أخذ العينة منه. وللقيام بذلك، أمسك النهايات اللاصقة باستخدام الإبهام والإصبع الوسطى، وضع الإصبع السبابة مقابل المربع المرسوم على ظهر الشريط.

ضع الشريط اللاصق على السطح المراد أخذ العينة منه، واضغط بلطف المنطقة المحددة مقابل السطح دون ترك حواف الشريط. استخدم إصبع السبابة للتأكد من ملامسة الجانب اللاصق من الشريط لسطح العينة بشكل كامل، مع تجنب تكون الفقاعات عبر استخدام حركة متساوية.

اسحب الشريط ببطء بعيداً عن العينة. إن الاستخراج الفيزيائي للميكروبات المرتبطة بالسطح يعمل على تثبيت الشحنة الخلوية. ضع الجانب اللاصق من الشريط على شريحة مجهر زجاجية، وباستخدام شريط مكتب شفاف عادي، تأكد من شد وتمديد الشريط بشكل صحيح لضمان تكوين سطح مستوٍ وخالٍ من التجاعيد.

سيساعد ذلك في تقليل المشكلات المتعلقة بتشوه الشريط أو التوائه أثناء التسخين اللاحق. وأثناء عملية التهجين، ضع الشريط ووجهه لأسفل على أطباق agri من نوع xylose slicing tertile four أو XLT four، بحيث تكون الخلايا التي تم أخذ عيناتها في تلامس مباشر مع سطح agri لتسهيل إزالة الشريط عن سطح agri.

بعد عملية الإثراء، يتم وضع جزء ملامسة العينة المطبوعة من الشريط بشكل مسطح مع سطح الآغار، ويتم لصق أحد طرفي الشريط بشكل فضفاض. تُقلب الجدران الجانبية لأطباق بتري لتجنب التكثف وتُحضن عند 35 degrees Celsius. وللسماح بنمو كافٍ لأنواع salmonella، فإن طول فترة التحضين اللازمة لإثراء الخلايا إلى مستوى يمكن اكتشافه سيعتمد على مستويات تلوث salmonella الأولية.

بعد انتهاء فترة الإثراء المطلوبة، افتح طبق الآجار، حيث سيحتفظ الشريط بلزوجته أثناء فترة التحضين. اضغط بلطف على الشريط فوق الآجار باستخدام إصبع السبابة لضمان أقصى استعادة للمستعمرات الدقيقة التي تكونت عند الواجهة الفاصلة بين الشريط والآجار، ثم أمسك الشريط من الحافة الملتصقة بجدار طبق بتري وأزله بحركة بطيئة ومنتظمة. باستخدام شريط لاصق مكتبي شفاف عادي، ثبّت شريط شحنة الخلايا بحيث يكون الجانب اللاصق للأعلى على شريحة مجهرية لإنشاء سطح مستوٍ وخالٍ من التجاعيد.

قم بإجراء تثبيت للخلايا على الشريط لمدة 30 دقيقة عند 25 °C عن طريق تغطية منطقة تلامس العينة بـ 500 µL من الفورمالين المنظم المتعادل بتركيز 10%. تخلص من المثبت في حاوية قابلة للإغلاق تحت غطاء كيميائي لتقليل التعرض للأبخرة المهيجة أو السامة، ثم اغسل الشريط مرة واحدة في محلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 1x أو PBS عن طريق غمر سطح الشريط برفق بـ PBS لترطيب العينة. باستخدام سلسلة تصاعدية من الإيثانول، قم بتحضير محاليل ما قبل التهجين والتهجين ومحاليل الغسيل باستخدام محاليل من الدرجة المخصصة للبيولوجيا الجزيئية التجارية، ثم قم بترشيحها باستخدام حقنة بمرشح 0.22 µm وسخن محاليل التهجين والغسيل مسبقاً إلى 55 °C.

أضف مجسات قليلة النيوكليوتيد الموصومة فلورياً إلى محلول التهجين المسخن مسبقاً للوصول إلى تركيز نهائي للمجس يبلغ 5 ng/µL، ثم قم بتغطية منطقة تلامس العينة ذات القالب على الشريط بـ 300 µL من محلول التهجين الذي يحتوي على مزيج المجسات. ضع الخلايا المرتبطة بالشريط المهجن في غرفة تحضين محكمة الإغلاق ورطبة مضبوطة على درجة حرارة 55 °C، وباستخدام حاضنة تلامس مباشر، مثل جهاز وضع الشرائح، يتم التهجين لمدة 15 دقيقة. بعد عملية التهجين، تُرفع الشرائح ويتم التخلص من طبقة محلول التهجين التي تحتوي على المجسات. اشطف الشرائح بشكل وجيز ولطيف باستخدام محلول غسيل مسخن مسبقاً عن طريق الماصة.

تسمح كمية صغيرة من المحلول المنظم فوق شريحة مائلة بجفاف الشرائح في الهواء من أجل الكشف عن أنواع السالمونيلا (salmonella) عبر المجهر الفلوري. غطِّ الشريحة بحوالي 10 µL من Vector Shield H 1200، وهو وسط تثبيت يحتوي على DAPI، صبغة تباين النواة، ثم حضنها في الظلام لمدة 10 دقائق. ضع زيت الغمر على غطاء الشريحة وافحص العينات باستخدام عدسة شيئية زيتية ذات تكبير عالٍ.

يُستخدم مرشح DPI لضبط تركيز العينة. بعد ذلك، يتم تحويل المجهر إلى المرشح المناسب، ويتم تقييم خلايا salmonella بصرياً بناءً على تألقها الأخضر أو الأحمر، وذلك اعتماداً على الصبغة المستخدمة لوسم المسابير. وللكشف عن طريق قياس التدفق الخلوي، تُنقل العينات المعلقة في PBS إلى أنابيب أخذ عينات ذات قاع مستدير سعة 5 مل ويتم فحصها باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي مع إثارة عند 647 nanometers.

قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo. يسهل أخذ عينات بشريط لاصق من سلالة terica serovar, Ty Murium من سطح حبة طماطم ملوثة اصطناعياً إجراء تحليل مباشر بعد الاصطياد عبر المجهر الإلكتروني أو شحن الخلايا في قياس التدفق الخلوي. تمت معالجة الأشرطة لإجراء تهجين سريع لـ C two باستخدام مجموعة من مسابير DNA المتخصصة لبكتيريا salmonella والموسومة بـ Texas Red، وذلك اعتماداً على التركيز المحلي الأولي لخلايا salmonella على الشريط.

أدى الإثراء في الطور الصلب إلى نتائج تتراوح ما بين مستعمرات مجهرية منعزلة ونمو متصل. يمكن تحليل الخلايا التي تم جمعها بواسطة الشريط عن طريق الجمع بين تقنية fish وقياس التدفق الخلوي، إما مباشرة بعد أخذ العينات أو بعد فترة حضانة سائلة لمدة خمس ساعات. تم إجراء الإثراء في مزارع مصغرة عند 35 درجة Celsius.

على الرغم من أننا وصفنا استخدام تقنية الشريط اللاصق لضمان سلامة الغذاء، إلا أن هذه الطريقة تمتلك أيضاً إمكانات جيدة للاستخدام في تخصصات أخرى، بما في ذلك الميكروبيولوجيا البيئية، أو أمراض النبات، أو الميكروبيولوجيا السريرية. وبالتوازي مع هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية مثل الاختبارات البيوكيميائية أو تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR على عمليات الإثراء في الطور الصلب أو السائل من العينات المستخلصة بالشريط. ويمكن استخدام هذه الاختبارات للإجابة على تساؤلات حول بكتيريا salmonella التي قد تكون موجودة، وهي تساؤلات تتجاوز نطاق إجراء الفحص الخاص بالأسماك.