كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن البكتيريا وتحديد نوعها باستخدام المستشعرات الكهروكيميائية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحرير الحمض الريبوزي النووي الريبوسومي (ribosomal RNA) أولاً من البكتيريا للسماح بالتهجين مع مسبار الكاشف المفلور، وفي الخطوة الثانية، يُضاف الحمض الريبوزي النووي الريبوسومي المرتبط بمسبار الكاشف إلى القطب العامل، مما يسمح بالتهجين مع مسبار الالتقاط الموجود على سطح المستشعر. بعد ذلك، يُسمح لمركب بيروكسيداز الفجل الحذري المضاد للفلوريسين بالارتباط بمسبار الكاشف المفلور.

أخيرًا، يمكن الحصول على تيار تداخل قياسي، ترتبط شدته بعدد معقدات مسبار الالتقاط الريبوسومي ومسبار كاشف RNA على سطح المستشعر. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق القائمة على المزارع في إمكانية اكتشاف البكتيريا وتحديد نوعها في غضون 45 دقيقة تقريبًا، مما يجنبنا فترة الانتظار الليلية المطلوبة لتكوين البكتيريا لمستعمرة مرئية على أطباق EDGAR. ومن شأن تطبيق هذه التقنية أن يحسن من إدارة الأمراض المعدية.

نظرًا لأن الكشف المبكر عن الممرضات البكتيرية أمر ضروري للعلاج الموجه بالمضادات الحيوية وتحسين النتائج السريرية. وبالرغم من أن هذه الطريقة مفيدة لتشخيص الأمراض المعدية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضًا على مشكلات تشخيصية أخرى مثل التشخيص المناعي. ابدأ بحضن مسبار الالتقاط المخفف مع hexane di thiol لمدة 10 minutes في درجة حرارة الغرفة لضمان اختزال مجموعة الثيول في مسبار الالتقاط، مما يؤدي إلى الحصول على نتائج أكثر اتساقًا.

بعدما تنتهي فترة الحضن، وجه تياراً من النيتروجين نحو رقائق مصفوفة المستشعرات الـ 16 المطلية بالذهب لمدة خمس ثوانٍ لإزالة أي رطوبة أو جسيمات. يجب تطبيق أحجام صغيرة من السائل بعناية على القطب العامل في مصفوفة المستشعرات. ويعد العرض المرئي لهذه التقنية أمراً بالغ الأهمية.

حيث أن الأداء السليم لتقنيات السحب الماص والغسل والتجفيف يقلل بشكل كبير من التباين بين الرقاقات. بعد ذلك، ضع 6 µL من مزيج مسبار الالتقاط المخفف HDT على القطب العامل لكل من الحساسات الـ 16 في مصفوفة الحساسات، واحفظ رقاقات الحساسات في طبق بتري مغطى عند 4 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، اغسل رقاقات الحساسات بالماء منزوع الأيونات لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوانٍ، ثم جفف الرقاقات تحت تيار من النيتروجين لمدة خمس ثوانٍ. الآن، ضع 6 µL من محلول attri hydrochloride sodium chloride, EDTA MERCAPTOETHANOL على القطب العامل لكل من الحساسات الـ 16، واحضن الحساسات لمدة 50 دقيقة في طبق بتري في درجة حرارة الغرفة.

لتحضير العينات لاختبار المستشعر الكهروكيميائي، انقل 1 mL من المزرعة البكتيرية في طور النمو اللوغاريتمي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة خمس دقائق عند 16,000 gs. يرجى ملاحظة أنه يجب التعامل مع البكتيريا المسببة للأمراض داخل خزانة السلامة البيولوجية.

بعد إزالة الـ snat، ضع طرف ماصة يحتوي على 10 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M في قاع أنبوب طرد مركزي صغير، ثم قم بالسحب والدفع بالماصة عدة مرات لإعادة تعليق الراسب تماماً. بعد تحضين المعلق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، أضف 50 µL من PBS يحتوي على ألبومين المصل البقري أو BSA ومسبار كاشف معدل بالفلوريسين لتحييد المحلل البكتيري. ثم قم بتحضين المحلل المحيد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ابدأ هذه الخطوة بغسل محلول الميركابتويثانول من إحدى رقاقات الاستشعار المجهزة باستخدام الماء منزوع الأيونات لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوانٍ. بعد تجفيف الرقاقة كما تم توضيحه للتو، ضع 4 µL من ناتج تحلل البكتيريا المُعادل على الأقطاب الكهربائية العاملة لـ 14 من المستشعرات.

ثم ضع أربعة µL من قليلة النيوكليوتيد الرابطة (bridging oligonucleotide) في محلول PBS مضافاً إليه BSA ومسبار الكاشف المعدل بالفلورسين على مستشعري التحكم الإيجابي. وبعد تحضين المستخلصات ومستشعرات التحكم الإيجابي لمدة 15 دقيقة، اغسل ثم جفف شريحة المستشعر بالكامل كما سبق. الآن ضع أربعة µL من مضاد الفلورسين بيروكسيداز الفجل الحصاني (anti fluorescein horse radish peroxidase) أو HRP في محلول PBS يحتوي على الكازين على الأقطاب العاملة لجميع المستشعرات الستة عشر.

بعد تحضين لمدة 15 دقيقة، اغسل شريحة الاستشعار وجففها. بعد ذلك، ضع ملصق بئر الغشاء على سطح شريحة الاستشعار وقم بتحميل الشريحة في حامل شريحة الاستشعار، ثم اسحب 50 µL من ركيزة TMB وضعها على جميع المستشعرات الستة عشر، وأغلق حامل شريحة الاستشعار. وأخيرًا، استخدم قارئ شرائح Helios للحصول على قياسات pyrometry والقياسات عن بُعد الدورية (cyclic telemetry) لجميع المستشعرات الستة عشر.

إن المقايسة الكهروكيميائية الموصوفة للتو مصممة بشكل مشابه إلى مقايسة ELISA الساندوتشية، كما هو موضح في هذا الشكل؛ حيث يتم الكشف عن تهجين RNA الريبوسومي المستهدف مع مجسات الالتقاط والكشف من خلال تفاعل أكسدة واختزال يحفزه إنزيم HRP المقترن بقطع أجسام مضادة لـ fluorescein ترتبط برابطة three pine fluorescein الموجودة على مجس الكشف. ومن المكونات الهامة لحساسية المقايسة هي الكيمياء السطحية للقطب الكهربائي الذهبي؛ حيث يتم طلاء القطب الذهبي بـ mercaptoethanol و hine ol، ثم يتم تفعيل وظيفته بإضافة مجسات التقاط مخففة.

يؤدي تهجين "السندويش" للـ RNA الريبوزومي المستهدف مع مسبار الالتقاط ومسبار الكاشف المسمى بـ fluorescein إلى تكوين معقد يتم الكشف عنه عن طريق إضافة Conjugate من anti fluorescein horse radish peroxidase وركيزة TMB. ويتولد التيار البارامتري M من خلال دورة الأكسدة والاختزال الناتجة عن أكسدة TMB بواسطة horseradish peroxidase واختزال TMB بواسطة الإلكترونات القادمة من القطب الكهربائي. وتستخدم المقاييس الموضحة هنا شريحة مصفوفة مستشعرات gene fluidic 16.

يحتوي كل مستشعر في المصفوفة على ثلاثة أقطاب كهربائية (قطب عامل، وقطب مرجعي، وقطب مساعد)، ولها نقاط تلامس عند حافة الشريحة. ويحتوي قارئ الشريحة على دبابيس pogo التي تتصل بكل نقطة من نقاط التلامس. يعمل قارئ الشريحة كواجهة لمصفوفة المستشعرات مع مقياس جهد يتم التحكم فيه بواسطة خوارزمية حاسوبية.

تظهر هنا أمثلة لتدفق التيار في مستشعر كهركيميائي. يكون تدفق التيار في المستشعرات مرتفعاً بشكل اصطناعي خلال الثواني القليلة الأولى بعد بدء القياسات البارامترية. ونظراً لتراكم الركيزة المؤكسدة خلال الفترة الممتدة من تطبيق TMB على سطح المستشعر وحتى بدء خوارزمية القارئ، يصل تدفق التيار بعد ذلك سريعاً إلى حالة مستقرة، ويمكن الحصول على قراءات دقيقة للمستشعر بشكل موثوق في غضون 60 ثانية.

يعتبر التباين من مستشعر إلى آخر ثابتاً نسبياً، لذا يمكن إجراء 16 مقايسة مستشعرات مختلفة بالتوازي على شريحة مصفوفة المستشعرات 16 الخاصة بسوائل الجينات. وتعد عناصر التحكم الموجبة والسالبة ضرورية؛ حيث يُستخدم في هذا السياق قليل نيوكليوتيد DNA جسري اصطناعي يتهجن مع كل من مجسات الالتقاط والكشف، ويعمل كهدف اصطناعي بتركيز معروف. وتعمل النتائج التي يتم الحصول عليها باستخدام قليل النيوكليوتيد الجسري كعنصر تحكم في المعايرة الداخلية لتقليل التباين من شريحة إلى أخرى.

كلما زاد التيار السالب للقطب الكهربائي، زادت الإشارة. عند اختبار مجسات الالتقاط والكشف، يجب تحديد حد الكشف عن طريق التخفيف التسلسلي لعينة ذات تركيز معروف؛ وكما هو موضح في هذا الشكل، هناك ارتباط خطي لوغاريتمي-لوغاريتمي بين تركيز العينة ومخرجات الإشارة عبر النطاق الديناميكي للمقايسة.

تظهر هذه الرسوم البيانية الشريطية النتائج التمثيلية للعينات التي تحتوي على esia coli و kleb seal والأمونيا، والتي توجد بشكل متكرر في بول المرضى المصابين بعدوى المسالك البولية، حيث ستكون الإشارات لمعظم المستشعرات منخفضة ومتشابهة، ويمكن تجميع هذه النتائج السلبية كإشارة خلفية، بينما يميز تفاعل زوج مسبار KE بين canon و e coli. يعمل قليلاً النيوكليوتيدات الجسري كضابط موجب ومعيار معايرة داخلي. يمكن تطبيق هذه التقنية للكشف عن البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية في العينات السريرية من خلال قياس الاستجابة المظهرية للبكتيريا تجاه المضادات الحيوية.

يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد العلاج الأمثل لكل مريض على حدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن البكتيريا وتحديد نوعها من خلال مقارنة التيارات الكهربائية في المستشعرات المختلفة النوعية الموجودة في الشريحة.