تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس حركية تصدير mRNA النووي في الخلايا الثديية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق الحقن المجهري لـ mRNA أو DNA أولاً في نوى خلايا المزارع النسيجية الثديية. وبعد الحقن المجهري، يتم تثبيت العينات بعد فترات حضانة متنوعة.

يتم بعد ذلك صبغ الـ mRNA عن طريق التهجين الموضعي المتألق (fluorescent in situ hybridization) أو تقنية fish. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تصوير الخلايا وقياس كمية الفلورة في السيتوبلازم والنواة. وفي النهاية، يمكن قياس معدل تصدير الـ mRNA من خلال مزيج من الحقن المجهري والمجهر الفلوري.

مرحباً، أنا SRG AV من مختبر أليكس بالازو في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة تورنتو. أنا ستيفان توسكي، أيضاً من مختبر بالازو. أنا إيمي من مختبر بالازو، وأنا خي ماها ديفيد من مختبر بالازو.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لإدخال mRNA في نويات خلايا زراعة الأنسجة الثديية عن طريق الحقن المجهري. كما سنوضح كيفية صبغ mRNA باستخدام التهجين الموضعي المتألق (fluorescent in situ hybridization). نحن نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة حركية تصدير mRNA من النواة في الخلايا الثديية.

لنبدأ الآن. قبل عملية الحقن المجهري، قم بتخفيف الحمض النووي البلازمي (plasma DNA) المُحضّر مسبقاً ليكون بتركيز يتراوح بين 50 و 200 micrograms per milliliter في محلول الحقن المنظم. بعد ذلك، أضف Oregon Green 488 أو OG المقترن بـ 70 kilodalton dextran إلى الخليط لتمكين تحديد الخلايا التي تم حقنها.

سيساعد الديكستران المقترن بـ OG في تحديد كمية السائل التي تم حقنها في النواة والكمية التي تسربت إلى السيتوبلازم. يتم طرد العينات مركزياً عند 13,000 G ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لترسيب أي مواد جسيمية قد تعيق طرف الإبرة. اختر خط الخلايا الثديية المراد حقنها مجهرياً بناءً على المعايير الموضحة في بروتوكول التكلفة المكتوب.

تُستخدم سبع خلايا لهذا النموذج التوضيحي. توضع الخلايا على شرائح غطاء مغسولة بالحمض في أطباق بتري بقطر 30 مليمتر قبل 24 ساعة على الأقل من الحقن المجهري. ومن الناحية المثالية، يجب أن تكون الطبقة الخلوية أحادية الطبقة متلاحمة بنسبة تتراوح تقريبًا بين 70 إلى 90% في وقت الحقن للسماح بتحديد الخلايا المحقونة بسهولة، ويتم إحداث جرح في الطبقة الخلوية أحادية الطبقة قبل الحقن باستخدام طرف ماصة بلاستيكية سعة 200 ميكرولتر.

قم بخدش جرح متصالب على غطاء الشريحة واترك الخلايا لتتعافى في حضانة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الحقن. بالنسبة للحقن المجهري، استخدم مجهراً مقلوباً معزولاً على طاولة هوائية لتقليل الاهتزازات التي قد تعيق عملية الحقن المجهري. باستخدام طرف تحميل هلام einor، قم بإزالة حوالي 1 µL من الجزء العلوي من عينة جهاز الطرد المركزي لتجنب تشتيت الراسب.

أدخل طرف الماصة في الطرف الخلفي لإبرة حقن مجهري مسبقة التصنيع ثم قم بتفريغ السائل. سينتقل السائل إلى طرف الإبرة بفعل الخاصية الشعرية. يجب أن يظهر سطح مقعر بالقرب من الطرف في غضون 5 إلى 30 ثانية.

ضع الإبرة المملوءة بالسائل في العصا وثبتها في المجهر الدقيق. وبزاوية 45 درجة، قم بمعاينة الإبرة باستخدام العدسة الشيئية 10x وضعها في مركز مجال الرؤية بالقرب من المستوى البؤري. باستخدام مقابض المجهر الدقيق الخشنة، يتم توصيل العصا عبر أنبوب بمحقنة زجاجية، والتي تُستخدم لتوليد الضغط اللازم لطرد السائل من طرف الإبرة.

للحفاظ على ضغط ثابت، يتم تثبيت المحقنة على مشبك أنابيب. باستخدام سدادتين مطاطيتين ومشبكين معدنيين، ارفع الإبرة بضعة مليمترات لمنع تلفها في الخطوات اللاحقة، ثم أرجع المجهر إلى الخلف. وبالضغط على مكبس المحقنة، قم بزيادة الضغط.

من 0.5 إلى 2 سنتيمتر مكعب. ضع طبق بتري يحتوي على شريحة غطاء ذات طبقة أحادية مجروحة. على منصة العرض، قم بإرجاع المجهر للخلف.

حرك العمود للأمام إلى وضع عمودي بحيث يتم محاذاة المكثف لتدخل الإبرة في السائل. يجب القيام بذلك بحذر لمنع كسر الإبرة على شريحة التغطية. باستخدام العدسة الشيئية 10x، حدد مركز التقاطع وضع الإبرة فوق الخلايا المراد حقنها.

قم بزيادة التكبير عن طريق الانتقال إلى العدسة الشيئية 40 x. بعد ذلك، قم بخفض الإبرة وتوسيطها باستخدام مقابض الضبط الدقيق في عصا التحكم. ابدأ الحقن عند إحدى زوايا تقاطع الجرح عن طريق خفض الإبرة لإحداث تلامس مع النواة.

بمجرد الحقن، يطرأ تغيير ملحوظ في سطوع طور الخلية. استمر على طول إحدى حواف صليب الجرح. ولضمان سهولة تحديد الخلايا المحقونة أثناء التصوير، من الضروري ضبط ضغط الحقن بشكل صحيح لكل إبرة.

يجب أن يكون الضغط مرتفعاً بما يكفي لاختراق الغشاء البلازمي والغشاء النووي، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى قتل الخلايا. قم بالحقن المجهري للخلايا على طول حافة الجرح لفترة زمنية محددة. ومع التدريب، يمكن حقن عدة مئات من الخلايا خلال هذه الفترة.

في حال حقن الحمض النووي البلازميدي (plasma DNA)، يتم تحضين الخلايا المحقونة مجهرياً عند 37 °C في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت، ثم يتم إيقاف عملية النسخ عن طريق معالجة الخلايا بـ 1 µg/mL من مادة alpha-amanitin المذابة في وسط النمو. تمنع هذه التركيزات عملية النسخ من البلازميدات المحقونة مجهرياً بشكل فعال.

أعد الخلايا إلى الحاضنة واتركها لتصدير mRNA المُصنع حديثاً. يمكن إعادة استخدام إبرة واحدة لحقن عدة شرائح غطاء. ومع ذلك، يجب استبدال الإبرة عند تغيير نوع DNA أو RNA الذي يتم حقنه مجهرياً.

علاوة على ذلك، بمجرد إزالة الإبرة من العصا، يجب التخلص منها للحصول على قياس دقيق لحركية تصدير mRNA من النواة. يجب تثبيت عينات منفصلة عند الدقيقة صفر، و15 دقيقة، و30 دقيقة، و60 دقيقة، و120 دقيقة. بعد المعالجة بـ alpha manin في الوقت المناسب، يتم سحب وسط النمو وغسل الخلايا مرتين في 2 mL من محلول PBS.

من المهم الحفاظ على رطوبة شرائح التغطية عن طريق تقليل الوقت الذي تقضيه دون غمر في السائل. قم بتثبيت الخلايا بإضافة 2 mL من الـ Aldehyde بتركيز 4% في PBS، ثم حضّن الخلايا لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل العينات المثبتة مرتين إضافيتين، قم بنفاذية الخلايا باستخدام 2 mL من Triton X 100 بتركيز 0.1% في PBS، ثم حضّن الخلايا مرة أخرى لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

أخيرًا، اغسل العينات مرتين إضافيتين لتحضيرها لعملية التهجين. اغسل الخلايا مرتين بمحلول غسيل من 1XSSC يحتوي على 25 إلى 60% formamide. ثم جهز غرفة التلوين للتهجين عن طريق تغطية قاع طبق بتري بقطر 150 millimeter بالماء وتعويم قطعة من paraformaldehyde على السطح.

قم بإزالة الماء عن طريق قلب الطبق، مما يسمح للبارافورم بالالتصاق بقاع الطبق. قم بإزالة أي فقاعات هواء يدوياً من كل شريحة غطاء سيتم صبغها. استخدم الماصة لإضافة قطرات بحجم 100 µL من محلول التهجين فوق البارافورم.

لاحظ أنه يجب تحسين كمية formage للبروتين السمكي المحدد المستخدم بمساعدة الملاقط. قم بإزالة غطاء الشريحة الذي يحتوي على الخلايا المثبتة من طبق بتري بقطر 30 millimeter. وباستخدام ورق ترشيح watman، جفف الجانب الخلفي من غطاء الشريحة وقم بسحب المحلول المنظم الزائد من الجانب الأمامي دون تجفيف الخلايا.

بعد ذلك، ضع غطاء الشريحة بحيث يكون الوجه لأسفل فوق محلول السمك. كرر هذه العملية لكل غطاء شريحة. بعد إعادة وضع غطاء حجرات الصبغ، حضّن العينات لمدة تتراوح من 5 إلى 18 ساعة عند 37 °C.

قم بتحضير عدة غرف غسيل بنفس الطريقة التي تم بها تحضير غرفة التصبغ؛ لكل شريحة غطاء، قم بنقل 1 mL من محلول الغسيل المنظم إلى البارافورم الخاص بغرفة الغسيل. بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة شرائح الغطاء من غرفة التصبغ عن طريق نقل 1 mL من محلول الغسيل المنظم. وبجوار شريحة الغطاء، يجب أن يسحب السائل تحت كل عينة عن طريق الخاصية الشعرية.

بعد ذلك، قم بإزالة أغطية الشرائح باستخدام الملقط وضع كل غطاء على قطرة من محلول الغسيل المنقوع في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. اغسل كل غطاء شريحة مرتين إضافيتين لإجمالي ثلاث غسلات لكل غطاء شريحة، ثم اسحب ما بين 10 إلى 30 µL من محلول التثبيت مع DAPI باستخدام الماصة وضعها على شريحة مغسولة مسبقاً. يمكن لكل شريحة استيعاب غطائي شريحة باستخدام الملقط وورق ترشيح واتمان.

جفف الجزء الخلفي من شرائح التغطية وقم بامتصاص السوائل الزائدة من الجانب الأمامي لشريحة التغطية دون تجفيف العينات. ضع كل شريحة تغطية مقلوبة على قطرة من محلول التثبيت. يمكن تخزين العينات المثبتة عند درجة حرارة 4 °C.

تظهر هنا تأثيرات alpha mantin على نسخ الحمض النووي DNA البلازميدي المحقون في خلايا NIH 3T3 الليفية، والتي عولجت مسبقاً بتركيزات متفاوتة من alpha mantin. تم حقن هذه الخلايا بـ TFL s delta i، والحمض النووي البلازميدي DNA و OG conjugated 70 kilo and dextran. يمثل كل صف مجال رؤية واحد تم تصويره لـ OG 70 kilodalton dextran و T uts delta I mRNA.

من الواضح أن التركيزات العالية من العقار قد ثبطت تمامًا إنتاج نسخة T UTS delta I، بينما لم يُلاحظ ذلك عند التركيزات المنخفضة. موضح هنا المسار الزمني لتكلفة التصدير النووي لـ mRNA. تم حقن سبع خلايا بـ T UTS delta i plasma DNA وديكستران بوزن 70 kilodalton مقترن بـ OG.

بعد 30 دقيقة من حقن الخلايا، عولجت الخلايا بـ alpha mantin وحُضنت عند 37 درجة Celsius لمدة صفر دقيقة، و60 دقيقة و120 دقيقة. ثم ثُبتت الخلايا وصُبغت بمسبار ضد T UTS delta I mRNA، وبأجسام مضادة ضد ER marker trap alpha، حيث يمثل كل صف مجالاً واحداً من الخلايا.

للحصول على معلومات حول كيفية قياس تصدير mRNA كمياً، يرجى الرجوع إلى النص المتاح عبر الإنترنت هنا. تم تكبير النقطة الزمنية 120 دقيقة. ولتوضيح التموضع المشترك لـ TFS delta I mRNA في الشبكة الإندوبلازمية (er)، يتم عرض تراكب لـ T UTS delta I mRNA باللون الأخضر وtrap alpha باللون الأحمر. يمكن العثور على معلومات حول كيفية صبغ mRNA المشترك مع البروتينات في النص المتاح عبر الإنترنت.

لقد شرحنا لكم للتو كيفية قياس حركية التصدير النووي لـ mRNA عن طريق الحقن المجهري. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الحقن المجهري الناجح يتطلب تحضيراً مناسباً. يتم وصف الخطوات الرئيسية مثل تحضير عينات DNA و RNA، وسحب الإبر، ومحاذاة المعدات البصرية، واستكشاف أخطاء الحقن المجهري وإصلاحها في البروتوكول المكتوب الخاص بنا.

عند تصوير وتحليل الـ mRNA المحقون مجهرياً، من المهم أن يقتصر التحديد الكمي على الخلايا التي استقبلت أكثر من 90% من السائل المحقون داخل النواة. ويمكن تقييم نجاح الحقن النووي من خلال معاينة توزيع الـ organ green dextran في النواة والسيتوبلازم. يرجى الرجوع إلى البروتوكول الخاص بنا عبر الإنترنت لمزيد من المعلومات حول تصميم مجسات الأسماك واستخدام برامج تحليل الصور لتحليل توزيع الـ mRNA في السيتوبلازم والنواة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.