أساليب لتصحيح تسجيلات السعة المشبك من كاليكس

مرحباً، اسمي كين باراديسو. أعمل مع لينج جانج وو في البرنامج الداخلي للمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، الواقع في مجمع معاهد الصحة الوطنية (NIH) في بيثيسدا. سأقوم بعرض تقنيات تسجيل ما قبل التشابك العصبي في الخلايا الكأسية باستخدام تثبيت الرقعة (Patch clamping).

لتحضير أنسجة الدماغ، نقوم باستئصال الدماغ من الجرذ. نضع الدماغ داخل هذا المحلول، وهو محلول منخفض الكالسيوم ومبرد بالثلج، ويتم تمرير الكاربوجين فيه لضمان وصول إمدادات الأكسجين إلى الدماغ في جميع الأوقات. كما يجب أن يكون المحلول مبرداً بالثلج لتقليل قدر التلف.

وبذلك يكون الدماغ الآن في هذا المحلول. نقوم بإخراجه، ثم قطعه بشكل مناسب بحيث يمكن وضعه على القاعدة، ويُثبت على القاعدة باستخدام Sano correlate أو الغراء السريع، ثم نملأ الحجرة بمحلول منخفض الكالسيوم شديد البرودة، ونقوم بتهويته، ثم نضعه على جهاز الاهتزاز، وبعد ذلك نقطع شرائح بسماكة 180 إلى 190 ميكرون، وبتردد شفرة يبلغ 70 هرتز، وسرعة تقدم للأمام تتراوح بين 0.01 إلى 0.02 مليمتر في الثانية. وهذا يعادل 10 إلى 20 ميكرون في الثانية.

بمجرد الانتهاء من عمل كل شريحة، نقوم بنقل الشرائح من المحلول الملحي المبرد بالثلج إلى هذه الحجرة، التي تحتوي على محلول كالسيوم طبيعي. هذا هو نفس المحلول الذي نستخدمه أثناء التسجيل، وهو عند درجة حرارة فسيولوجية تبلغ 37 °C. بعد ذلك، نضع الشرائح هنا لفترة التعافي.

يُترك الدماغ هنا لمدة تتراوح بين نصف ساعة وساعة قبل إجراء تجارب الفسيولوجيا. والآن لدي الدماغ وسأقوم بإخراجه من المحلول. هذا الدماغ أكبر حجماً لأغراض التوضيح.

هذا من جرذ في اليوم العشرين بعد الولادة (P 20). سنقوم بقلبه. إن جذع الدماغ هو الجزء الذي نهتم به.

لذا فإن هذه المنطقة هنا والسبلة التي تم الإمساك بها تقع تقريباً في تلك المنطقة هناك. لذا، سنقوم بقطع بقية الدماغ، وعزل جذع الدماغ، ثم تحضير جذع الدماغ لغرفة التقطيع. حسناً، سنقوم بتقطيع بقية الدماغ لعزل جذع الدماغ فقط.

سأقوم بقلبه الآن لتوضيح موقعنا الحالي. في المعتاد، لن نفعل ذلك بهذه الطريقة، ومرة أخرى، يمكننا ببساطة التخلص من ذلك الجزء بالكامل. عند قلبه مرة أخرى، نكون قد عزلنا جذع الدماغ وسنقوم بإجراء قطع آخر هنا تماماً.

حسناً، هذا كل شيء. هذا هو جذع الدماغ. يقع Calyx of held في تلك المنطقة وهناك.

هذا هو جذع الدماغ. سنقوم بدفعه للخلف قليلاً مرة أخرى. سنقطع أحد جانبي المخيخ، وهو ما سيسمح لجذع الدماغ بأن يستقر بشكل جانبي على هذا النحو.

نضع كمية صغيرة من غراء Sano acrylic، ومع إبقاء العينة في وضع جانبي، نملؤها بسرعة بالثلج البارد ومحلول منخفض الكالسيوم البارد. يتم إدخال خط الأكسجين في أسرع وقت ممكن. نقوم الآن برفعها ونقلها إلى جهاز الهزاز (vibrato).

نقوم بإدخاله بسرعة للوصول إلى بداية الدماغ، وبمجرد وصولنا إلى بداية الدماغ، نخفض السرعة إلى 0.01 millimeters per second. أي أنها 10 micros per second. وبالتالي، فهو يتحرك بمعدل بطيء للغاية.

الجزء الأول من الدماغ هو الجزء الذي يحتوي على mtb، وهو الجسم شبه المنحرف الإنسي (medial nucleus of the trapezoid body). وهذا هو الجزء الذي يحتوي على، حسناً، بمجرد وضعه في ماصة النقل، أحاول تقريبه قدر الإمكان من طرف الماصة. وهنا توجد شريحة الدماغ، وأقوم بنقلها بسرعة إلى هذه الغرفة، التي تحتوي على محلول تسجيل قياسي بمستويات طبيعية من الكالسيوم ودرجة حرارة أعلى.

وسيتيح ذلك للشرائح التعافي بعد إجراءات التقطيع لتصبح جاهزة لتجارب الفسيولوجيا. حسنًا، من هذه النقطة فصاعدًا، ستتكرر نفس الخطوات مرارًا وتكرارًا. المعدات التالية هي ما سأستخدمه لإجراء تثبيت الرقعة (patch clamping).

لدينا مجهر عمودي ذو منصة ثابتة. وكما ذكرت، فإن المنصة ثابتة، لذا يتحرك المجهر أسفلها بواسطة مناور. نستخدم مناورًا دقيقًا من طراز wigs and Newman لتثبيت المنصة، وبالنسبة لرأس مضخم الإشارة، فإننا نستخدم مضخم تثبيت الغشاء (patch clamp amplifier) من طراز EPC 10 من شركة heca.

ومن الأمور التي كان يجب أن أذكرها أيضاً هي أننا نستخدم تقنية DIC مع الضوء تحت الأحمر. لذا، لدينا كاميرا IR هنا، وبالتالي فإن كل ما نراه سيظهر على الشاشة عندما نبحث عن CAEs. يتم التحكم في مضخم patch clamp بواسطة هذا البرنامج المسمى Pulse، وهو أيضاً من إنتاج شركة Heca، ومن خلاله نتحكم في المضخم وفي جميع تفاصيل التجربة الفسيولوجية.

ستظهر النتائج على هذه الشاشة. يُعتبر Calyx الذي تم الإمساك به طرفاً قبل مشبكي كبيراً، وبسبب حجمه هذا، فإنه يسمح لنا بإجراء عملية الترقيع (patch) فيزيائياً على الطرف المشبكي. لذا يمكننا أخذ تسجيلات قبل مشبكية، وهو أمر فريد من نوعه، خاصة في الجهاز العصبي المركزي (CNS).

وهذا يتيح لنا قياس قنوات الكالسيوم التي يتم تنشيطها قبل التشابك. كما يمكننا أيضاً قياس نشاط جهد الفعل إذا أردنا تحفيز العصب الذي يؤدي إلى الكاليكس. ما نقوم به في هذا المختبر هو قياس عملية تسمى الإخراج الخلوي، وهي اندماج الحويصلات التي تحتوي على الناقل العصبي مع الغشاء.

والآن، عندما تندمج هذه الحويصلات مع الغشاء في العملية التي تسمى الإخراج الخلوي (exocytosis)، فإنها تضيف غشاءً إلى النهاية التشابكية، ويمكننا قياس ذلك كإزاحة في السعة الكهربائية. سنحصل على زيادة في السعة الكهربائية مع إضافة الغشاء إلى النهاية التشابكية؛ لذا فإن التجارب التي سأعرضها اليوم هي قياسات للسعة الكهربائية، قبل التشابكية، وعندما يتم إزالة الغشاء. فمن البديهي أنه لا يمكنك الاستمرار في إضافة الغشاء فحسب، بل يجب عليك إزالة جزء منه.

تُسمى هذه العملية بالالتقام الخلوي (endocytosis) أو الامتصاص الغشائي. يمكننا أيضاً قياس ذلك، حيث يظهر القياس على شكل انخفاض في مستوى السعة الكهربائية، وسنعرض أمثلة على ذلك لاحقاً. والآن، يتيح لنا هذا مراقبة نشاط قنوات الكالسيوم، وكذلك مراقبة بعض البروتينات المشاركة في عمليتي الإخراج الخلوي (exocytosis) والالتقام الخلوي ودراستها.

يمكننا إضافة مواد مثل الببتيدات لِحجب البروتينات المشاركة في عملية الإخراج أو الإدخال الخلوي. كما يمكننا استخدام السموم التي تؤدي الغرض ذاته. وبإمكاننا أيضاً ضبط كميات الكالسيوم التي تدخل إلى النهاية العصبية، مما يتيح لنا دراسة عملية الإخراج الخلوي، وإطلاق الناقل العصبي، بالإضافة إلى عملية استعادة الغشاء التي تلي هذا الحدث.

هذا هو الأنبوب الذي يحتوي على محلول التسجيل داخل الخلوي. نقوم بتحضيره مسبقاً ثم نجمده، وعادةً ما يمكننا استخدامه لعدة أسابيع إلى شهر قبل الحاجة إلى تحضير محلول جديد. ومرة أخرى، فكرنا مباشرة قبل إجراء التسجيلات، حيث ستجد دائماً قدراً معيناً من جزيئات الغبار أو أنواعاً أخرى من الشوائب التي ستنفذ إلى الأنبوب.

يمكنك القيام بأحد أمرين؛ إما إخراج المحلول وترشيحه، أو طرده مركزياً لمدة دقيقة أو دقيقتين ثم سحب المحلول، مع ترك جزء سفلي يحتوي على الحطام والمواد الأخرى. لذا، أفضل القيام بالطرد المركزي، وسأفعل ذلك الآن.

هذا هو الأنبوب الذي يحتوي على المحلول داخل الخلوي. لقد تم إذابته. سنقوم بطرده مركزياً لمدة تتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق في جهاز طرد مركزي صغير جداً، ومن شأن ذلك أن يكون كافياً لإزالة أي جزيئات غبار كبيرة من المحلول.

والآن، أقوم بسحب الطبقة العلوية، وهي المحلول الذي قمنا بطرده مركزياً للتو، مع الحرص على عدم تحريكه، ونقله إلى أنبوب نظيف، حيث أسحب حوالي 90% منه. وأحاول مجدداً تجنب سحب الكمية الصغيرة المتبقية في النهاية، لذا سأتوقف عند هذه النقطة تقريباً.

أضع هذا على الثلج فوراً ليبقى بارداً جداً خلال التجربة، وهذا أمر بالغ الأهمية. هذه إحدى الماصات التي نستخدمها.

نستخدم هذه الماصة للتسجيلات داخل الخلوية. وهي مصنوعة من زجاج السيليكا ذي الجدران السميكة، بقطر خارجي يبلغ 2 millimeters وقطر داخلي يبلغ 1.16 millimeters. أولاً، نقوم بملء الماصة من الخلف.

لذلك نقوم بتطبيق عملية الشفط، حيث نضع الماصة في محلول التسجيل ونطبق الشفط لمحاولة ملء طرف الماصة الدقيق جداً، والذي لن يمتلئ بأي طريقة أخرى. وبمجرد القيام بذلك، نأخذ أنبوباً شعرياً ونملأ بقية القطب الكهربائي ببساطة عن طريق إمساك مؤخرة الماصة. هذه تقنية فسيولوجية قياسية تعتمد حرفياً على تحريكها بنقرة سريعة.

قد تخاطر بكسر طرف الماصة، ولكن إذا لم تفعل ذلك، فغالباً ما ستظهر فقاعات هوائية. حسناً، سنقوم الآن بوضعها على حامل الماصة، المتصل بمرحلة الرأس في مضخم تسجيل الجهد الموضعي (patch clamp amplifier). يوجد هناك سلك من كلوريد الفضة.

يتلامس سلك كلوريد الفضة مع المحلول داخل الخلوي، مما يسمح لنا بقياس النشاط الكهربائي في النهاية قبل التشابكية. لذا، فإن ما نقوم به هو البحث عن الشريحة التي تحتوي على عدد كبير من CAEs، حيث إننا نسعى للحصول على كثافة عالية من CAEs.

لذا، نحن نبحث عن النواة الإنسية للجسم شبه المنحرف، والتي يُرمز لها بـ MNTB، وهي المنطقة التي يوجد بها العائق النهائي، أو ما يُعرف بـ calyx app. وبناءً على ذلك، نبدأ بمسح الشريحة؛ فعلى سبيل المثال، يوجد هنا calyx يقع في عمق معين بعيداً عن السطح ولا يوجد الكثير للالتصاق به، لذا نواصل المسح عبر الشريحة.

هذا هو الكأس (calyx) الذي نستهدفه هنا. لقد وضعت علامتين على الشاشة، حيث سيوجه الماصّ (pipette). ويمكنكم رؤية قطعة الكأس التي سأستهدفها عند نزول الماصّ.

سأقوم بتطبيق ضغط إيجابي لدفعه للأعلى عكس الكأس، ومن ثم سأقوم بتخفيف هذا الضغط الإيجابي. عندها سيدفع الكأس الماصة للأعلى، وفي تلك اللحظة سأقوم بتطبيق شفط خفيف جداً وأحاول شفط ودفع الغشاء أو جعل الغشاء يلتصق بطرف الماصة. حسناً، تم تخفيف الضغط الإيجابي.

والآن سأقوم بتطبيق الشفط. لذا، سنقوم هنا بتطبيق نبضة بقيمة 5 mV، أو في الواقع نبضة بقيمة 4 mV. حسناً، هذا كل شيء. حسناً.

الآن سنقوم بخفض جهد الغشاء إلى 80-، لإلغاء الطفرة العابرة السريعة. سننتقل الآن إلى وضع الخلية الكاملة. سأقوم بتطبيق شفط خفيف ومحاولة الانتقال إلى وضع الخلية الكاملة.

تشير هذه العوابر الشحنية إلى أن الماصة والخلية أصبحتا الآن متصلتين، وأنه قد حصل على تسجيل شامل. هذه لقطة رائعة أخرى. لذا، كان اللون الأحمر الفاتح هناك يمثل أثر السعة، ويمكنك أن ترى وجود قفزة مفاجئة ثم انخفض بعدها.

حسنًا، لقد عرضتُ لكم للتو التقنيات الأساسية للحصول على تسجيلات من النهاية الطرفية قبل المشبكية للكأس (calyx upheld presynaptic terminal). كما أوضحتُ لكم كيفية تحضير المقاطع التي تحتوي على النواة الإنسية للجسم شبه المنحرف (medial nucleus of the trapezoid body)، وهو الموقع الذي ستجدون فيه الكؤوس (calyxes) التي تم تثبيتها.

وقد أوضحتُ لكِ التقنيات المستخدمة لفحص المقاطع. ستقومين بمراجعة كل مقطع من المقاطع للبحث عن المقطع الذي يحتوي على أكبر عدد من خلايا caly الموجودة على السطح. بعد ذلك، ستبحثين عن أكبر غشاء خلية caly يمكنكِ إيجاده، ثم تقومين بإجراء تسجيل باستخدام تقنية patch clamp عليه.

وقد عرضتُ لكم أيضاً تقنيات تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording)، وهي تقنيات قياسية لتسجيل تثبيت الرقعة.