تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

الهدف العام من الإجراء التالي هو توضيح كيف أن توحيد بنية الخلايا ومواقعها، والذي يتم تحقيقه باستخدام أنماط دقيقة لاصقة محددة، يسمح بأتمتة سهلة لعملية الحصول على الصور ومعالجة مباشرة لها مع قياس كمي دقيق وقوي لتأثيرات الأدوية، وهو أمر لا يمكن تحقيقه باستخدام ركائز شرائح الغطاء الزجاجية التقليدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق استزراع خلايا heli على رقائق SI two التي تحمل أنماطاً دقيقة من SI three على شكل حرف L. تكتسب الخلايا شكلاً مثلثاً حيث يتكون ليف إجهاد رئيسي يمتد بين طرفي حرف L. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا الموجودة في الأنماط مع lebos statin أو تترك بدون معالجة، ثم يتم تثبيتها وصبغها لتصور الهيكل الخلوي لـ acton والنوى.

يتم بعد ذلك الحصول على صور الخلايا ذات الأنماط الدقيقة ومعالجتها باستخدام الماكرو cell ref لإنشاء مجموعة من الصور المكدسة للتحليل، والماكرو hypotenuse لتحديد الأنماط الظاهرية كمياً. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر تأثيراً ملحوظاً للجرعات المنخفضة من BLEs statin على خلايا HELOC ذات الأنماط الدقيقة، وهو أمر لا يمكن كشفه في ظروف الزرع الخلوي القياسية. مرحباً بكم.

نحن هنا اليوم لنصحبكم في جولة عبر البروتوكول التجريبي الخاص بنا، والذي يشرح كيفية استخدام الأنماط المجهرية اللاصقة لتحليل الخلايا، بالإضافة إلى عرض بيانات تجريبية توضح سهولة قياس الجرعات المنخفضة جداً من العقاقير على هذه الأنماط المجهرية اللاصقة. فعند رؤية هذه الأنماط المجهرية لأول مرة، ستدركون على الفور كيف يمكنها حل مشكلات التباين في التقاط الصور أثناء تحليل الخلايا؛ وذلك لأنه من خلال امتلاك مصفوفة فعلية من الخلايا، تشبه إلى حد كبير المصفوفات المجهرية، يمكنك تحريك منصة المجهر بسهولة من خلية إلى أخرى لتتمكن من التقاط الصور بطريقة تتابعية.

ولكن هذه ليست الميزة الوحيدة التي توفرها الأنماط الدقيقة بالطبع؛ فهي تقدم تحسينات أكبر بكثير لأنه في الواقع، ومن خلال استخدام أنماط دقيقة نموذجية معينة مثل شكل الصليب أو حرف Y، فإننا نقوم بتوحيد البنية الداخلية للخلية، مما يعني أن العضيات، والمغزل الانقسامي، والهيكل الخلوي، وشبكات البروتين المختلفة تكون جميعها في المواقع نفسها من خلية إلى أخرى أو في الاتجاه نفسه من خلية إلى أخرى، وهو ما يجعل من السهل التنبؤ بآثار الأدوية على هذه الأنماط المحددة وقياسها كمياً. وقد يبدو هذا الأمر منافياً للمنطق مقارنة بما يتم فعله عادةً في أطباق بتري التقليدية أو الأطباق الدقيقة.

حسنًا، لأنك غالبًا ما ترى بالطبع خلايا تتحرك وتتخذ أشكالًا مورفولوجية مختلفة. بينما في الأنماط الدقيقة اللاصقة، ستبدأ جميع الخلايا في أن تبدو متشابهة لأنها تستجيب لهذا النمط الدقيق اللاصق وتنظم بنيتها بنفس الطريقة. قد يبدو هذا في الواقع اصطناعيًا بعض الشيء، ولكن عندما تتأمل الأمر عن كثب، أليس طبق بتري أكثر اصطناعية؟

نظرًا لأن الخلايا في الأنسجة تكون مقيدة بالخلايا المجاورة وكذلك بالمصفوفة خارج الخلوية، فإنها تتلقى الكثير من المعلومات المكانية التي تعمل على توجيه البنية الخلوية. وهذا هو الهدف من استخدام الأنماط الدقيقة الذي نقوم به هنا.

نحن نقوم باستعادة هذه المعلومات المكانية للخلايا، وتستجيب جميع الخلايا لذلك وتنتظم بالطريقة نفسها. والآن، بما أن جميع الخلايا تبدو متشابهة، يمكننا تقديم مفهوم الخلية المرجعية، مما يعني أنه يمكننا حساب متوسط جميع الصور والحصول على صورة واحدة تمثل بشكل حقيقي مظهر الخلية في حالة معينة. بعد ذلك، يمكنك إضافة دواء والنظر مرة أخرى إلى تلك الخلية المرجعية لمعرفة كيف قام بتعديل مورفولوجيا الخلية أو تنظيمها استجابةً لهذا الدواء.

ضع شريحتين من نوع situ two بشكل فردي في بئرین مستقلين من طبق يحتوي على ستة آبار، مع التأكد من أن شعار situ two مقروء. تحتوي شرائح situ two المستخدمة في هذه التجربة على أنماط دقيقة مصبوغة بـ FibroGen SI three ويجب حفظها في الظلام قبل الاستخدام. اجمع خلايا hela التي وصلت درجة تلاقيها إلى 80% تقريبًا باستخدام التريبسين، وتحقق من تفردهم بشكل صحيح تحت المجهر، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 G لمدة أربع دقائق وأعد تعليق الخلايا بلطف، ثم قم بعد الخلايا وتخفيفها لتصل إلى تركيز 15,000 خلية لكل milliliter.

قم بتوزيع 60,000 خلية في كل بئر باستخدام وسط زراعة D-M-E-M-F 12 غير المكتمل. يجب تحريك الطبق بأقل قدر ممكن لتجنب إحداث حركات دورانية في الوسط، والتي قد تؤدي إلى تركيز الخلايا في المركز. اترك الخلايا تترسب لمدة 10 دقائق تحت غطاء التدفق الصفائحي، ثم انقلها إلى حاضنة الخلايا.

خلال 10 إلى 20 دقيقة في حاضنة الخلايا، ستبدأ الخلايا في الالتصاق بعد 10 دقائق؛ تحقق بانتظام تحت المجهر للتأكد من التصاق الخلايا. قم بتغيير وسط الخلايا وإزالة الخلايا الزائدة عن طريق تكرار الإجراء التالي أربع مرات. مع الحفاظ على استواء الطبق، اشفط الوسط برفق من جانب البئر.

يجب الحرص على الاحتفاظ بكمية كافية من الوسط الغذائي لتجنب جفاف الشريحة. أضف 4 mL من PBS وقم بالشفط بدءاً من مركز الشريحة. ثم انتقل إلى جانب البئر لشفط معظم الـ PBS كما في السابق، وافحص تحت المجهر للتأكد من وجود خلايا طافية.

إذا بقيت كمية كبيرة من الخلايا العائمة، كرر إجراء الغسيل. أما إذا كان عدد الخلايا قليلاً جداً، فقم بشفط جزء من محلول PBS واستبدله بـ 2 mL من الوسط الغذائي الطازج، وكرر عملية الشفط وإضافة 4 mL من الوسط الغذائي الطازج مرتين. قم بتحضين الخلايا لمدة 3 ساعات في حاضنة خلايا للسماح لها بالانتشار بشكل كامل.

باستخدام هذه الطريقة، سيتم شغل ما بين 10 و 30% من الأنماط الدقيقة بخلية واحدة، بينما ستكون الأنماط الأخرى إما فارغة أو مشغولة بخلايا متعددة. لمعالجة الخلايا بـ BLEs statin، قم بتخفيف المحلول المخزون من الدواء بتركيز 17 millimolar إلى تركيز نهائي قدره 5 micromolar باستخدام 0.1% DMSO في 4 milliliters من الوسط الغذائي. أما بالنسبة لعينة الضبط، فقم بتحضير وسط غذائي يحتوي على 0.1% DMSO فقط؛ ثم اسحب الوسط الغذائي للخلايا واستبدله سريعاً بمحاليل BLEs statin أو محاليل الضبط لتجنب جفاف الشريحة.

حضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. وأثناء عملية التحضين هذه، قم بتحضير منظم الهيكل الخلوي. أضف 1 g من السكروز إلى 2 mL من cb.

يساعد هذا في الحفاظ على البنى الخلوية الداخلية. اخلط 1 mL من سكروز CB مع 4 mL من 5% PFA. أضف 2 mL من محلول PFA في سكروز CB.

في بئرَيْن من طبق سداسي الآبار جديد. لتثبيت الخلايا، استخدم ملقطاً لالتقاط شريحة CY two ووضعها في الطبق سداسي الآبار الذي يحتوي على 2 mL من PFA في محلول CB sucrose. تُحضن الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يُزال PFA وتُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS، وبعد ذلك تُغسل الخلايا بـ 2 mL من كلوريد الأمونيوم بتركيز 100 mM لمدة 10 دقائق.

لإيقاف نشاط الربط التشابكي المتبقي لـ PFA، يتم جعل الخلايا نفاذة عن طريق إضافة 2 mL من PBS يحتوي على 0.1% tritton X 100 لمدة ثلاث دقائق، ثم تُغسل مرتين بـ PBS؛ صبغ خيوط الأكتين باستخدام 2 mL من ZI conjugated fain بنسبة تخفيف 1:2000 في PBS مع 1.5% BSA مع التحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 2 mL من PBS. تلى ذلك صبغ النوى.

أضف 2 mL من محلول بتركيز 1 mg/mL في PBS واتركه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل مرتين باستخدام 2 mL من PBS. قم بتثبيت الشريحتين الجانبيتين على شريحة قياسية باستخدام 25 إلى 30 µL من محاليل التثبيت مثل al.

لالتقاط صور بثلاثة أطوال موجية، نستخدم برنامج التصوير Metamorph ومجهر NIK icon eclipse T. الجهاز مزود بكاميرا CCD Hema Matsu ومُضيء ألياف زئبقي من نوع intens lite. ابدأ باختيار قوة تكبير 20 x.

بعد ذلك في شريط القائمة، افتح خيار "multidimensional acquisition" لضبط المعاملات المختلفة للتجربة. حدد أولاً مكان حفظ البيانات الخاصة بك.

اضبط عدد الأطوال الموجية على ثلاثة، وحدد خيار SI للأطوال الموجية الثلاثة، ثم ضع شريحة غطاء الغطاء بحيث تتمركز 12 نمطاً دقيقاً في مجال الكاميرا. سيختلف عدد الأنماط الدقيقة المرئية في كل مجال اعتماداً على إعدادات الكاميرا والعدسة الشيئية. اضبط وقت التعرض لكل طول موجي وقم بتفعيل التركيز التلقائي.

بالنسبة لـ PS three، قم بإنشاء سجل تشغيل للاكتساب متعدد الأبعاد واحفظه باسم MDA jnl. افتح وظيفة مرحلة المسح (scan stage) لاكتساب 24 صورة تحتوي كل منها على 12 نمطًا دقيقًا. أدخل ستة أعمدة وأربعة صفوف مع حجم خطوة x مقداره minus 400 micron، وحجم خطوة y مقداره 300 micron في "set journal" للتنفيذ، ثم قم بتحميل السجل MDA jnl واضغط على scan لبدء الاكتساب الآلي للصور الـ 24 بالأطوال الموجية الثلاثة.

في هذا الفيديو، تُستخدم أنماط دقيقة على شكل حرف L لتحفيز تكوين ليفة إجهاد أكتينية رئيسية واحدة تدعم الجزء غير الملتصق من الخلية، وذلك لتبسيط تصور وقياس تأثير الـ BLEs statin على الخلايا مقارنة بالخلايا المستقرة على الفبرونكتين السادة. ومن أجل المعالجة والتحليل الآلي للصور، نستعرض اثنين من الماكروز المصممة خصيصاً والمكتوبة لبرنامج Image J مفتوح المصدر؛ حيث يقوم الماكرو الأول باستخراج الخلايا الفردية وإنشاء خلية مرجعية من مجموعة من الصور الخام، بينما يقوم الماكرو الثاني بقياس انهيار غشاء الخلية.

تتمثل الخطوة الأولى في تقسيم الخلايا الفردية من الصور الخام. تُستخدم صور الأنماط الدقيقة المحددة بالفلورسنت لتحديد المناطق المتمركزة حول الأنماط الدقيقة، والتي يتم قصها من الصور لكل طول موجي وإعادة تجميعها في مجموعات لكل طول موجي. ولاختيار الأنماط الدقيقة التي تحتوي على خلايا مفردة، يقوم الماكرو برصد عدد النوى في كل صورة واستبعاد الصور التي تحتوي على أكثر من نواة واحدة أو لا تحتوي على أي نوى من جميع المجموعات.

أخيرًا، تُستخدم إضافة multi-stack reg في برنامج image J لإعادة محاذاة جميع الصور التي تم جمعها وجميع القنوات استنادًا إلى موقع النمط الدقيق (micropattern). تُنتج هذه الخطوة مجموعات خطية (line stacks) من الصور الفردية التي يمكن استخدامها الآن لتحليل الخلية الواحدة أو لإنشاء خلية مرجعية. وفي برنامج image J، يتم بناء الخلية المرجعية عن طريق عمل إسقاط (projection) للصور المصفاة والمحاذات من مجموعة الصور (stack).

يمكن تطبيق عدة طرق للإسقاط، ولكن عادةً ما يتم اختيار الإسقاط الوسيط للتخلص من القيم المتطرفة في مجموعة الصور المتراكمة. وتُعد الخلية المرجعية أداة فريدة ومفيدة للتمثيل وتحليل الصور، ولا يمكن الحصول عليها إلا باستخدام الخلايا ذات الأنماط الدقيقة. ولتسهيل فحصها، يتم تطبيق جدول بحث أو LUT لتحويل الصورة أحادية اللون إلى خريطة تردد مشفرة.

لتوصيف تأثير الستاتين على BLEs، تم تحليل صلابة الخلية وانهيارها باستخدام ماكرو ثانٍ من برنامج Image J. وباختصار، تُستخدم صور العتبة للنمط الدقيق L لتحديد وتر نظري للشكل المثلثي للخلية. بعد ذلك، يتم إجراء تحديد العتبة لصور صبغة الأكتين لتحديد شكل الخلية.

يتم بعد ذلك قياس الفرق في المساحة بين الوتر النظري وغشاء الخلية المقعر الفعلي؛ وتُعتبر الخلايا التي تظهر مساحة تقع أسفل الوتر النظري خلايا منهارة. تم توصيف تأثير 5 µM من BLEs statin من خلال مقارنة عدد الخلايا المنهارة في ظروف المعالجة ومجموعات الضبط. تظهر الصور النموذجية لخلايا L ذات الأنماط الدقيقة المعالجة بـ BLEs statin أو التي تركت دون معالجة، حيث تم تثبيت الخلايا وصبغ الأنماط الدقيقة.

يظهر الأكتين والنوى باللون الأحمر والأخضر والأزرق على التوالي. لاحظ تأثير statin BLEs على شكل الخلية مقارنة بظروف التحكم. تظهر هنا خلايا ممثلة بعد الحضن مع statin BLEs أو مجموعات التحكم على فيبرونيكتين بسيط.

تم تثبيت الخلايا وصبغها، ويظهر الأكتين والنوى باللونين الأخضر والأزرق على التوالي. يلاحظ التشابه بين الظروف المعالجة وظروف المراقبة. تظهر صور نموذجية لخلايا مرجعية تم الحصول عليها من خلايا عولجت بـ BLEs statin أو تركت دون معالجة.

لاحظ إمكانية استخدام هذا النهج للمراقبة السهلة للنمط الظاهري قيد الدراسة. إليك مثال على تحليل آثار BLEs statin على الخلايا باستخدام الوتر الكلي. وبينما تعرضت 25% من الخلايا الضابطة للانكماش، ارتفعت هذه النسبة ثلاث مرات لتصل إلى 75% في الخلايا المعالجة بـ BLEs statin بتركيز 5 µM، مما يعكس ضعف شبكة الأكتينين التقلصية.

بعد مشاهدة هذا المقطع، من المفترض أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية قيام الأنماط الدقيقة اللاصقة بحل العديد من العقبات في التحليل عالي المحتوى. أولاً، جعل استخدام الأنماط الدقيقة اللاصقة من عملية تحليل التقاط الصور أكثر سهولة ومباشرة. ثانياً، تسمح الأنماط الدقيقة بالكشف عن التأثيرات الطفيفة جداً للأدوية عند جرعات منخفضة للغاية، وذلك لأنك تقلل من التباين بين خلية وأخرى من خلال توحيد شكلها وسلوكها.

وأخيراً، وبالمقارنة مع آلاف الخلايا التي تكون ضرورية عادةً للحصول على نتيجة جيدة في تحليل الخلايا، فإنك تحتاج فقط إلى بضع عشرات من الخلايا للحصول على نتيجة قوية وهامة باستخدام الخلية المرجعية الخاصة بنا.