مولد الرمع الفحص : خلايا منتسب

مرحباً، اسمي Lum وأقوم حالياً بدراسة الدكتوراه في معهد BE IDI للقلب والسكري تحت إشراف الدكتور Tom Carianne، رئيس مختبر الطب الإبيجينومي. سأقوم في هذا الفيديو بشرح الإجراء المعروف باسم مقايسة بقاء المستعمرات (Clon Genic Survival Assay). وهي تقنية يعود تاريخها إلى 50 عاماً، وتسمح بتقييم تأثير العلاجات المختلفة، مثل التعرض للإشعاع أو العوامل الكيميائية، على القدرة التكاثرية للخلايا.

يعتبر مقايسة بقاء الخلايا متجانسة السلالة تقنية مركزية في علم الأحياء الإشعاعي لتقييم الحساسية الإشعاعية لخطوط خلوية مختلفة واختبار فعالية المركبات المختلفة الواقية من الإشعاع أو المحسسة له. عند استخدام خط خلوي ملتصق، تتكون مقايسة البقاء بالتبريد من ثلاث مراحل. أولاً، معالجة طبقة واحدة من الخلايا الملتصقة.

ثانياً، تحضير معلق خلوي أحادي وتوزيع عدد معروف من الخلايا في أطباق مطلية، وثالثاً، صبغ وعدّ المستعمرات المتكونة بعد فترة من الحضن. في هذا الفيديو، سأستخدم خلايا مخلدة من سلالة human cino site لتوضيح كيفية استخدام مقايسة polygenic Bible لتحديد خصائص الوقاية الإشعاعية لمضاد أكسدة طبيعي. يتم استزراع الخلايا مسبقاً في دوارق T25 بـ 5 mL من الوسط الغذائي، بحيث يكون هناك 1 مليون خلية في كل دورق في يوم التجربة.

يتم إضافة 50 µL من العقار بتراكيز مختلفة إلى 5 mL من الوسط الغذائي في كل دورق مُعلم بشكل مناسب لتحقيق التركيز المطلوب؛ حيث تُستخدم خمسة تراكيز بالإضافة إلى مجموعة ضابطة واحدة باستخدام المذيب (vehicle control)، وهو في هذه الحالة PBS. وبعد إضافة العقار، تُحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة في الظروف المناسبة لسلالة الخلايا المستخدمة. وبعد الحضن، تُعرض الدوارق، باستثناء المجموعة الضابطة، للإشعاع بالجرعة المختارة، والتي تبلغ في هذه الحالة 4 Gy الناتجة عن مصدر سيزيوم باعث لأشعة غاما.

بعد التشعيع، يتم سكب الأوساط الغذائية وغسل كل قارورة بـ 2 mL من PBS لمدة خمس دقائق. وبعد سكب الـ PBS، يُضاف 2 mL من trypsin بتركيز 0.05% إلى كل قارورة لفصل الخلايا الملتصقة من جدار القارورة. ثم يُضاف 5 mL من DMEM الذي يحتوي على 10% fetal bovine serum إلى كل قارورة لإبطال مفعول الـ trypsin.

يتم بعد ذلك نقل كامل محتويات القارورة إلى أنابيب فالكون سعة 10 milliliter مصنفة. وبمجرد الانتهاء، تُوضع هذه الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق، وبعد ذلك يتم التخلص من المادة الطافية بعناية دون تعكير الراسب، ويُضاف 5 mils من وسط crecy إلى كل أنبوب. كما يتم حساب تركيز الخلايا لكل عينة، بالإضافة إلى الحجم المطلوب من كل عينة لتحقيق التركيز النهائي للخلايا المراد توزيعها في خمسة أطباق بتري لكل عينة، مع إضافة خمسة milliliters من الوسط لكل طبق.

على سبيل المثال، بالنسبة للمجموعة الضابطة، يتم زرع 100 خلية في كل طبق، وبناءً على ذلك يتم حساب الحجم اللازم لتحقيق 500 خلية لكل 25 ملليلتر؛ أما بالنسبة للعينات الأكثر تركيزاً، فيتم إجراء تخفيف بمقدار 10 مرات أو تخفيف تسلسلي بمقدار 100 مرة لتقليل الخطأ الناتج عن استخدام أحجام أقل من 100 µL. والآن، يتم تحضير الحجم المحسوب سابقاً في أنبوب Falcon يحتوي على 25 ملليلتر من الوسط الغذائي لكل عينة. ويمكن الآن نقل العينات إلى أطباق تم تسميتها مسبقاً، مع إضافة خمسة ملليلتر إلى كل طبق لتسهيل عملية المناولة والنقل.

تُحفظ الأطباق في حاوية كبيرة معقمة أو مطهرة. ثم توضع الأطباق في حضانة رطبة تحت الظروف المناسبة وتُحضن لمدة ثمانية أيام. في حال استخدام الخلايا الكيراتينية بعد ثمانية أيام، تُزال الأطباق بعناية من الحضانة وتوضع جميعها واحدة تلو الأخرى داخل خزانة استخلاص الأدخنة.

احرص على التعامل مع الأطباق برفق حتى لا تضطرب أي مستعمرات قد تكونت. قم بإزالة الأغطية وأضف 5 mls من المحلول الملحي بتركيز 0.9% إلى كل طبق لغسله. وجه رأس الماصة نحو زاوية الطبق وتجنب لمس قاع الطبق حتى لا يتم كشط أي مستعمرات عن طريق الخطأ.

بعد مرور خمس دقائق، يتم سحب المحلول الملحي بعناية. الآن، تُثبت المستعمرات باستخدام ثلاثة ملليلتر من تركيز 4%، ويجب استبدال الأغطية لتجنب التبخر. بعد مرور 15 دقيقة إلى نصف ساعة، يتم سحب المحلول والتخلص منه بشكل مناسب.

أصبحت المستعمرات الآن جاهزة للصبغ باستخدام Crystal violet بتركيز 0.1%، حيث يُضاف خمسة مليليترات إلى كل طبق، ثم تُعاد الأغطية بعد مرور نصف ساعة إلى ساعة واحدة. بعد ذلك، يُغسل الصبغ بالماء المقطر، وتُقلب الأطباق وتُترك لتجف طوال الليل. الآن أصبحت المستعمرات جاهزة للعد.

يمكن عد المستعمرات يدويًا باستخدام مجهر تشريحي. وتعتبر أي مجموعة من الخلايا تحتوي على 50 خلية أو أكثر بمثابة مستعمرة. وبهذا نكون قد انتهينا من عرض اختبار بقاء السلالات المتجانسة (Congenic survival assay).

تكمن الميزة الرئيسية لهذا المقايسة مقارنة بالتقنيات الأخرى في حساسيتها العالية وقدرتها على كشف البقاء على مدى واسع حتى بعد قتل الخلايا بمقدار ستة لوغاريتمات. ويتحقق هذا المستوى من الحساسية عن طريق زراعة أعداد أكبر من الخلايا. ويمكن استخدام هذه المقايسة بسهولة لأغراض أخرى، مثل اختبار السمية الخلوية.

شكراً للمشاهدة.