تحريض مستضد خيفي محددة استعطال الإنسان في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى التي تحفيز مستضد خيفي مع حصار العلامة المشارك تنشيطية

الهدف العام من التجربة التالية هو تنشيط الخلايا التائية للمانح المتوافقة مع مستقبلات متغايرة (allo specific donor T cells) عن طريق التحفيز خارج الجسم (ex vivo) باستخدام مستضدات متغايرة من المستقبل، وذلك بوجود أجسام مضادة تمنع التحفيز المشترك للخلايا التائية بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد عبر مستقبل CD 28 الخاص بها. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) من مانحين سليمين مختلفين. بعد ذلك، يتم إعداد استزراع مشترك لتنشيط المتغايرات (bulk allo energizing co-culture) عن طريق تحضين مجموعات PBMC غير المتوافقة من حيث مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) بوجود أجسام مضادة أحادية النسيلة للربيطات B 7.1 و B 7.2 لمنع تحفيز CD 28.

بعد ذلك، يتم قياس فعالية التنشيط الخيفي (allo energization) من خلال تفاعلات الخلايا الليمفاوية المختلطة الأولية والثانوية أو MLR. وأخيراً، يتم قياس النوعية الخيفية للتنشيط الخيفي عن طريق تحديد الاستجابات النوعية لطرف ثالث ولـ CMV. تم الحصول على نتائج تظهر أن الخلايا التائية للمتبرع أصبحت منخفضة الاستجابة للتحفيز المستضدي الخيفي اللاحق، ولكن الخلايا التائية للمتبرع غير المتفاعلة خيفياً ظلت سليمة ووظيفية.

لقد وظفنا هذه الاستراتيجية بنجاح في تجارب سريرية رائدة سابقة ومستمرة لحقن خلايا T من متبرع منشطة خيفياً أثناء وبعد زراعة الخلايا الجذعية غير المتوافقة من حيث مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA)، ولاحظنا تحسناً في إعادة تشكيل المناعة، وانخفاضاً في عدد الإصابات بالعدوى، وشدة أقل في مرض الطعم ضد المضيف الحاد والمزمن مقارنة بما لوحظ في المجموعات الضابطة التاريخية من متلقي عمليات زراعة غير متوافقة من حيث HLA دون معالجة. وتتمثل الميزة الرئيسية لاستراتيجية التنشيط الخيفي في تقليل التأثيرات غير المستهدفة، حيث إن هذه التقنية لا تقلل من استجابات خلايا T النوعية لمسببات الأمراض أو المستضدات المرتبطة بالأورام، ولا تقضي على خلايا T التنظيمية CD4 من مجمع خلايا T الخاصة بالمتبرع. ستقوم كريستين فين، الباحثة في مختبرنا، بتوضيح هذا الإجراء. الخطوة الأولى هي سحب الدم من متبرعين متطوعين صحيحين.

ستعمل الخلايا المأخوذة من متبرع واحد كمستجيب، بينما ستعمل الخلايا المأخوذة من متبرع آخر كمحفز. بعد ذلك، يتم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) من الدم عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة باستخدام fial pac. يتم صبغ كمية صغيرة من الخلايا بـ trian blue، ثم يتم عد خلايا PBMC الحية باستخدام hemo cytometer reus.

قم بتعليق خلايا PBMC من كل متبرع في 10 milliliters من وسط استزراع مكتمل بتركيز 1 مليون خلية حية لكل milliliter في أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 milliliter. خصص أنبوبة واحدة من خلايا PBMC للمتبرع كخلايا محفزة (stimulators) والأخرى كخلايا مستجيبة (responders) لإعداد الاستزراع المشترك للتنشيط الخيفي الجماعي (bulk allo energizing co-culture).

أضف 100 micrograms من الأجسام المضادة anti B 7.1 و anti B 7.2 إلى أنبوب الـ 15 milliliter المخصص للمحفز. رج الأنبوب برفق واتركه للحضانة لمدة 30 minutes. بعد فترة الحضانة، قم بتعريض خلايا PBMC المحفزة للإشعاع وأضفها إلى دورق زراعة خلايا T 25 50 cubic centimeter مزود بغطاء نفاذ للغازات.

ضع ملصقاً على القارورة باسم "bulk allo coal culture". بعد ذلك، أضف 10 milliliters من خلايا PBMC المستجيبة من المتبرع الآخر بتركيز 1 million per milliliter في وسط غذائي كامل إلى القارورة. أضف 100 micrograms إضافية من كل من الأجسام المضادة antib 7.1 وAntib 7.2 إلى القارورة واخلط المزيج بلطف قبل وضع القارورة في وضع عمودي داخل الحاضنة لمدة 72 hours.

بعد ذلك، قم بتشعيع 10 ملايين أخرى من خلايا PBMC المحفزة من أجل إنشاء مزرعة مشتركة ضابطة شاملة بدون أجسام مضادة حاجزة، ثم أضفها إلى دورق زراعة خلايا T 25 بسعة 50 cubic centimeter. قم بتمييز الدورق بعبارة "مزرعة مشتركة ضابطة شاملة". أضف 10 milliliters من خلايا PBMC المستجيبة نفسها المستخدمة في المزرعة المشتركة للتنشيط الخيفي الشامل بتركيز 1 مليون per milliliter في وسط غذائي كامل إلى الدورق، وامزج الخليط بلطف قبل وضع الدورق في وضع عمودي داخل الحاضنة لمدة 72 hours.

تتمثل الخطوة التالية في قياس وظيفة تجمع الخلايا التائية المانحة التي تم تنشيطها خيفياً في نفس يوم زراعة المجموعات الضخمة؛ قم بتسمية طبق 96 بئراً بقاع على شكل حرف U بـ "primary MLR" لكل نقطة زمنية من النقاط الثلاث المراد قياسها. بعد ذلك، قم بسكب 5 mL من كل من زراعات المجموعات الضخمة الضابطة والمجموعات التي تم تنشيطها خيفياً في أنابيب سعة 15 mL.

بعد ذلك، قم بسحب 200 µL من معلق الخلايا من كل أنبوب ووضعها في آبار مكررة ثلاث مرات على كل لوحة من الألواح الثلاثة. قم بتسمية هذه الآبار "بدون حصر التحفيز المشترك" أو "no CSB" للخلايا المستمدة من مزارع التحكم الشاملة الباردة، و"CSB" للخلايا المستمدة من مزارع تنشيط الخيفات الشاملة الباردة. ثم أضف 200 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى ستة آبار في كل لوحة لتكون بمثابة ضوابط سلبية.

أخيراً، أضف 200 µL من PBS إلى جميع الآبار الفارغة لتقليل التبخر، ثم ضع الأطباق في الحاضنة لمدة 72 ساعة بعد إعداد المزارع المشتركة الضخمة. قم بتسمية طبق UBO ذو 96 بئراً بـ "secondary MLR" لكل نقطة زمنية من النقاط الثلاث المراد قياسها. ولتحضير الخلايا المستجيبة لـ secondary MLR، انقل 5 mL من كل من المزارع المشتركة الضابطة (control) والمحفزة خيفياً (allo energizing) إلى أنابيب سعة 15 mL، ثم قم بطرد مركزي للأنابيب لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق بسرعة 2000 RPM في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين إضافيتين عن طريق سحب الـ SNAs بعناية، وتفكيك الرواسب، وإضافة 10 mL من الوسط الغذائي الكامل إلى كل أنبوب، ثم قم بطرد مركزي للخلايا مرة أخرى بعد الغسلة الثانية.

أعد تعليق الخلايا في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل. استخدم صبغة tripan blue لتعداد الخلايا الحية، ثم اضبط تركيز الخلايا ليصل إلى 1 مليون خلية مستجيبة حية لكل 1 mL. انقل 100 µL من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى آبار مكررة ثلاث مرات في كل طبق.

قم بتسمية هذه الآبار بـ "الطرف الأول" (first party) أو "تحفيز سبيكة FP". بعد ذلك، انقل 100 microliters من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى ثلاثة آبار أخرى في كل طبق، وقم بتسمية هذه الآبار "تحفيز CD 3/28" لـ PBMC من نفس المتبرع الذي استخدم لتوفير PBMC المحفز للطرف الأول في عملية allo. تُستخدم المزارع المشتركة النشطة والضابطة كخلايا محفزة لـ MLR الثانوية؛ قم بتعليق 10 million من PBMC المتبرع الطرف الأول بتركيز 1 million per milliliter ثم قم بتشعيعها وإضافتها.

أضف 100 µL من الخلايا المحفزة المشععة إلى الآبار المسمى fp allo restimulation في كل طبق MLR ثانوي. وبالنسبة للضوابط الموجبة، أضف 1 µL من كل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة CD3 و CD28 و 98 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى الآبار المسمى CD 3 28 stimulation في كل طبق MLR ثانوي. بالإضافة إلى ذلك، أضف 200 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى ستة آبار فارغة في كل طبق لتعمل كضوابط سالبة، وأضف 200 µL من PBS إلى جميع الآبار الفارغة لتقليل التبخر.

ضع الأطباق في الحاضنة. الخطوة التالية هي قياس نوعية خلايا PBMC الخيفية المعزولة من متبرع سليم جديد يُسمى متبرع الطرف الثالث، والتي تُستخدم لاختبار نوعية العملية الخيفية في تفاعل MLR ثانوي. قم بتعليق خلايا PBMC الخاصة بالطرف الثالث بتركيز 1 million cells per milliliter، ثم قم بتشعيعها وتسمية 3 أطباق 96-عينات بتسمية secondary MLR specificity للأيام three و five و seven.

لتحضير الخلايا المستجيبة لتفاعل الخلط اللمفاوي (MLR) الثانوي لقياس النوعية، انقل 5 mL من كل من المزارع المشتركة الضابطة الشاملة والمزارع المشتركة المنشطة خيفياً إلى أنابيب سعة 15 mL، ثم قم بطردها مركزياً لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق بسرعة 2000 RPM. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين عن طريق شفط السوائل الطافية بعناية، وتفكيك الرواسب، وإضافة 10 mL من الوسط الغذائي الكامل إلى كل أنبوب، ثم طرد الخلايا مركزياً مرة أخرى بعد الغسلة الثانية. أخيراً، أعد تعليق الخلايا في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل.

استخدم صبغة tripan blue لعد الخلايا وضبط تركيزها ليصل إلى 1 مليون خلية مستجيبة حية لكل milliliter، ثم انقل بواسطة الماصة 100 microliters من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى آبار مكررة ثلاث مرات في كل لوحة. ضع علامة TP أو تحفيز طرف ثالث خيفي (third party allo stimulation) على هذه الآبار. بعد ذلك، أضف 100 microliters من خلايا المحفز TP المشععة إلى الآبار التي تحمل علامة TP allo stimulation.

ولمزيد من اختبار خصوصية استجابات التباين الخيفيّ (allo responses)، يتم قياس الاستجابات للممرضات بعد تنشيط خلايا PBMC من متبرعين لديهم استجابات تكاثرية مثبتة مسبقاً لفيروس CMV. يتم وضع علامات على أطباق الآبار 96 كـ "M-L-R-C-M-V" لليوم الثالث والخامس والسابع، ونقل 5 milliliters من كل من المجموعة الضابطة الكلية ومزارع التنشيط الخيفيّ إلى أنابيب سعة 15 milliliter. بعد ذلك، يتم غسل الخلايا وعدّها وإعادة تعليقها بتركيز 1 million لكل milliliter في وسط غذائي كامل. يتم سحب 100 microliters من معلق الخلايا من كل أنبوب وتوزيعها في ثلاثة آبار في كل طبق، وتسمية هذه الآبار بـ "تحفيز CMV".

بعد ذلك، أضف 0.1 µL من محلول CMV الليزي في 100 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى الآبار المسمى CMV stimulation. ثم أضف 200 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى ستة آبار في كل طبق كضوابط سلبية. وأخيرًا، أضف 200 µL من PBS إلى جميع الآبار الفارغة لتقليل التبخر، وضع الأطباق في الحاضنة لقياس التكاثر في تفاعل MLR الأولي والثانوي.

أضف 1 micro curry من التيميدين المسمى بالتريتيوم إلى عينة الضبط السلبية والآبار التي تحتوي على الخلايا قبل 16 ساعة من حصاد الأطباق. اجمع التيميدين على حصيرة ترشيح واحدة لكل طبق باستخدام جهاز حصاد TomTec أو جهاز مشابه. جفف حصائر الترشيح لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، ضعها في أكياس عينات فردية. أضف 5 mL من سائل الوميض إلى كل منها ثم أغلقها بإحكام. قم بقياس دمج tri thymidine خلال الـ 16 ساعة الأخيرة من التجربة عن طريق قراءة لبادات الترشيح باستخدام عداد وميض بيتا دقيق من نوع wallach، أو جهاز مماثل باستخدام خلايا PBMC مستجيبة ومحفزة ذات عدم تطابق في HLA.

يمكن ملاحظة أن وجود حصار التحفيز المشترك في تفاعل اللمفاويات المختلط (MLR) الأولي يقلل من متوسط التكاثر الخيفي لخلايا PBMC المستجيبة في اليوم الخامس إلى حوالي 30% مما لوحظ في تفاعل MLR الأولي الضابط في غياب حصار التحفيز المشترك. وهذا يعادل تثبيطاً متوسطاً للتكاثر الخيفي الأولي بنحو 70% في اليوم الخامس، كما هو موضح في هذا الشكل.

يمكن ملاحظة أنه في تفاعل اللمفاويات المختلطة (MLR) الثانوي، يكون تكاثر الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) المنشطة خيفيًا تجاه الطرف الأول عادةً في اليوم الخامس ما بين 10 إلى 15% مما يُلاحظ في خلايا PBMC الضابطة. وهذا يعادل متوسط تثبيط للتكاثر يتراوح بين 85 إلى 90%، مما يثبت أن خلايا PBMC المنشطة خيفيًا تكون منخفضة الاستجابة للمنبهات الخيفية للطرف الأول. وكما يتضح في هذا الشكل، يمكن إعداد المزارع المشتركة الكلية المتقنة للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي للمانح المنشطة خيفيًا في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات.

يمكن توحيد هذا النهج بسهولة للاستخدام السريري لإنتاج خلايا T من المتبرع ذات تفاعلية خيفية منخفضة، مع الحفاظ على المناعة النوعية الموجهة لمسببات الأمراض. ويمكن نقل هذه الخلايا بالتبينا في سياق زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفية لتحسين إعادة بناء الجهاز المناعي دون حدوث داء الطعم ضد المضيف بشكل مفرط. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بسرعة.

يساعد هذا في الحفاظ على حيوية الخلايا وتجنب التنشيط غير النوعي أو فقدان الخلايا المقدمة للمستضد. في حال استخدام خلايا PBMC المحفوظة بالتجميد للمحفزات أو المستجيبين، يجب استخدام بروتوكول معتمد لإنعاش الخلايا المجمدة يضمن الحصول على عوائد عالية ومستمرة من الخلايا الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية allo-anize لخلايا الدم المحيطية أحادية النواة من متبرع بشري، وكيفية إجراء المقايسات لتقييم فعالية ونوعية هذا الإجراء؛ إذ يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لتوليد خلايا T من متبرع بشري ذات استجابات allo مختزلة، والتي يمكن استخدامها سريرياً لتحسين إعادة بناء الجهاز المناعي بعد زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفية.