باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

تستخدم هذه العملية شريحة Viro، وهي مقايسة مصفوفة ميكروية شاملة للفيروسات لتحليل العينات السريرية بحثاً عن الفيروسات المعروفة وغير المعروفة على حد سواء. أولاً، يتم استخلاص الأحماض النووية من العينات السريرية. بعد ذلك، يتم نسخ الـ RNA المستخلص عكسياً باستخدام بادئات عشوائية.

يتم إجراء تخليق الشريط الثاني من الـ CD NA وتضخيم مكتبة الـ CD NA باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) العشوائي. بعد ذلك، يتم وسم الـ cd NA المُضخّم بصبغات فلورية وتهجينها بمصفوفة مجهرية شريحية فيروسية. وتتمثل الخطوة النهائية في مسح المصفوفة المجهرية وتحليلها.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تبين وجود أو غياب فيروس واحد أو عدة فيروسات من خلال تحليل مصفوفة الرقاقة الدقيقة. إن طرق الكشف واسعة النطاق، مثل مصفوفة الرقاقة الفيروسية، ضرورية في الميكروبيولوجيا التشخيصية لأن المتلازمات السريرية الشائعة، مثل الالتهاب الرئوي، ليست مرتبطة بممرض واحد محدد، وبسبب التهديد المستمر الناشئ عن ممرضات فيروسية جديدة مثل فيروس SARS Coronavirus وفيروس الإنفلونزا novel H1N1 لعام 2009. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الميكروبيولوجيا التشخيصية، مثل النسبة المئوية للعدوى غير المشخصة في السياق السريري التي قد تكون ناتجة عن فيروسات جديدة لم يتم تحديدها بعد. وتمتد آثار هذه التقنية نحو تشخيص أفضل للأمراض السريرية الحادة في المستشفى لأننا نقوم بفحص مئات إلى آلاف الممرضات المحتملة في وقت واحد.

جاءت فكرة هذه الطريقة لأول مرة في عام 2002 عندما قررنا تطبيق تقنية المصفوفات الدقيقة (microarrays) التي تم تطويرها حديثاً وبدأت في مختبر الدكتور Joseph DeRisi في جامعة كاليفورنيا بسان فرانسيسكو (UCSF) للكشف عن الفيروسات. وكانت أول حالة اختبار واقعية هي استخدام الشريحة الفيروسية لتحديد فيروس كورونا المستجد المسؤول عن متلازمة SARS في عام 2003. وسيقوم فني من مختبري بتوضيح الإجراء من البداية إلى النهاية، حيث سيقوم باستعراض استخدام مقايسة الشريحة الفيروسية على عينة مسحة أنفية مأخوذة من طفلة لتشخيص سبب مرضها التنفسي الحاد. تُجمع عينات مسحات البلعوم الأنفي في حاويات معقمة تحتوي على وسائط سائلة لنقل الفيروسات، وتُحفظ مجمدة في مجمد بدرجة حرارة -80 °C.

داخل خزانة السلامة البيولوجية، اترك الأنبوب الذي يحتوي على العينة ليفك تجميده وقم بتقليب المسحة لفترة وجيزة في الوسط الغذائي قبل التخلص من المسحة في حاوية نفايات المواد الخطرة بيولوجياً. بعد ذلك، قم بنقل 200 µL من العينة إلى أنبوب سعة 1.5 mL. قم بتمرير العينة عبر مرشح طرد مركزي بمسامية 0.22 micron لتنقيتها من الجسيمات الفيروسية ونقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، استخدم مجموعة Turbo DNA من شركة Ambien وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لتحليل الحمض النووي الجينومي للعائل وتنقية الحمض النووي الفيروسي المغلف والمحمي. اتبع ذلك باستخلاص الـ RNA، باستخدام مجموعة XMO ZR لاستخلاص الـ RNA الفيروسي أو مجموعة Qiagen ultrasound للفيروسات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس تركيز الـ RNA المستخلص باستخدام مقياس طيف NanoDrop للأحماض النووية.

يُفضل أن يكون تركيز RNA على الأقل 10 nanograms لكل µL، ولكن هذا التركيز قد يختلف من عينة إلى أخرى باستخدام أنبوب رقيق الجدار سعة 200 µL. أضف 1 µL من البادئ A بتركيز 40 PICA moles لكل µL إلى 4 µL من الـ RNA المستخلص. سخّن العينة عند 65 °C لمدة خمس دقائق في جهاز التدوير الحراري، ثم اترك الأنبوب ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، أضف خمسة ميكرولتر من المزيج الرئيسي (master mix) الذي يحتوي على اثنين ميكرولتر من منظم RT بتركيز 5x، وميكرولتر واحد من DNTP بتركيز 12.5 millimolar، وميكرولتر واحد من الماء، و0.5 ميكرولتر من DTT بتركيز 0.1 molar، و0.5 ميكرولتر من reverse transcriptase في جهاز الدوري الحراري (thermocycler). حضّن الأنبوب عند 42 °C لمدة 60 دقيقة. ثم سخّن العينة إلى 94 °C لمدة دقيقتين.

لإيقاف تفاعل إنزيم النسخ العكسي، يتم التبريد عند 10 degrees Celsius لمدة دقيقتين ثم استخدام جهاز الطرد المركزي النبضي لمدة خمس ثوانٍ. بعد ذلك، أضف خمسة µL من خليط quease المكون من واحد µL من منظم quease بتركيز 5x، و3.8 µL من الماء، و0.15 µL من quease لتخليق الشريط الثاني. قم برفع درجة حرارة جهاز الدورات الحرارية من 10 degrees Celsius إلى 37 degrees Celsius على مدار ثماني دقائق.

يُحضن المزيج عند 37 °C لمدة ثماني دقائق. بعد ذلك، يُسخن عند 94 °C لمدة دقيقتين لتعطيل إنزيم الـ quease، ثم يُبرد إلى 10 °C عند هذه النقطة. وإذا رغبت في ذلك، يمكن تخزين العينة التي تحتوي على 15 µL من الـ CDNA عند -20 °C.

أولاً، أضف 5 µL من عينة CD NA إلى 45 µL من المزيج الرئيسي (master mix) المكون من 5 µL من منظم PCR بتركيز 10x، و1 µL من dNTP بتركيز 12.5 mM، و1 µL من البادئ B بتركيز 100 pmol/µL، و1 µL من cleantech LA، و37 µL من الماء. ثم قم بتشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي: 94 °C لمدة دقيقتين، تليها 25 دورة تتكون من 94 °C لمدة 30 ثانية، و50 °C لمدة 45 ثانية، و72 °C لمدة دقيقة واحدة.

ثم تلي ذلك خطوة تلدين عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، تليها مرحلة حفظ عند 10 درجات مئوية بعد تفاعل PCR. يتم فحص ناتج PCR باستخدام هلام كهربائي من agarose بتركيز 1.5%. يجب أن يظهر لطخة تمتد من 200 إلى 1000 زوج قاعدي تقريباً.

لدمج AAD DNTP، أضف 5 µL من ناتج PCR الفيروسي إلى 45 µL من المزيج الرئيسي (master mix) المكون من 5 µL من منظم PCR بتركيز 10x، و1 µL من A-A-D-N-T-P بتركيز 12.5 mM، و1 µL من بادئ (primer) B بتركيز 100 p، و1 µL من ClinTech LA و37 µL من الماء. قم بتشغيل بروتوكول PCR على النحو التالي: 94 °C لمدة دقيقتين، و15 دورة تتكون من 94 °C لمدة 30 ثانية، و50 °C لمدة 45 ثانية.

درجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم خطوة تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، والاحتفاظ عند 10 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تنقية ناتج PCR الجديد باستخدام طقم DNA clean and concentrator three وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ويذاب في 10 µL من محلول elution buffer. أضف 1 µL من بيكربونات بتركيز 1 M و 1 µL من si three إلى الـ 10 µL من ناتج PCR، ثم يتم التحضين لمدة ساعة واحدة في الظلام.

بعد ذلك، قم بتنظيف العينة المحددة بـ S مجددًا باستخدام طقم DNA clean and concentrator five وقم باستخلاصها في 12 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer). استخدم 1.5 µL من العينة لفحص تركيز CDNA وكمية الصبغة المدمجة باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop في أنبوب PCR strip، مع إضافة 1 µL من fragmentation buffer 25x، و 5 µL من blocking buffer 5x، و 9.5 µL أو الكمية اللازمة للوصول إلى تركيز نهائي معياري قدره 10 pmol/µL من العينة المحددة بـ SI3، والماء حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 25 µL. ثم أضف 25 µL من GX hybridization buffer 2x، وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لإزالة الفقاعات.

ضع شريحة حشية جديدة في غرفة التهجين. قم بتحميل 40 µL من العينة على شريحة الحشية. بعد ذلك، ضع مصفوفة الفيروسات المطبوعة من Agilent بحيث يكون الجانب المميّز بعلامة Agilent لأسفل فوق شريحة الحشية، وأحكم ربط المسمار جيداً.

ضع غرفة التهجين في فرن عند درجة حرارة 65 درجة مئوية وقم بإجراء التهجين طوال الليل مع تدوير بطيء بمعدل 10 دورات في الدقيقة لغسل المصفوفات. أولاً، قم بتسخين المنظم الثاني مسبقاً حتى 37 درجة مئوية أثناء التسخين. املأ حاوية بلاستيكية سعة 500 ملليلتر بنحو 250 ملليلتر من المنظم الأول.

أخرج المصفوفة من غرفة التهجين، ثم اغمر المصفوفة وافصلها عن شريحة الحشية. انقل المصفوفة إلى حاوية نظيفة واغسلها في المحلول المنظم الأول لمدة دقيقة واحدة. ثم باستخدام حاوية بلاستيكية منفصلة سعة 500 milliliter.

اغسل المصفوفة في المحلول المنظم الثاني المسخن مسبقاً لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسيل، أخرج المصفوفة ببطء من المحلول المنظم الثاني، مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات.

استخدم مناديل Kim wipe لامتصاص الرطوبة الزائدة، مع الحرص على تجنب لمس الجانب النشط من المصفوفة بشكل مباشر. وأخيراً، ضع الشريحة في حامل الشرائح بحيث يكون جانب Agilent للأعلى، ثم أدخلها في ماسح المصفوفات. في هذا الإجراء، نستخدم ماسح Agilent two micron DNA microarray.

قم بمسح مصفوفة SI ذات العلامات الثلاث بدقة خمسة ميكرونات أو ميكرونين وفقاً لبروتوكول المسح القياسي للجهاز. حلل المصفوفات الدقيقة الفيروسية (viral chipp microarrays) عن طريق تحليل العنقود (cluster analysis) أو برنامج تحليل RO chipp الآلي e unpredic. باستخدام المصفوفة الدقيقة Viro Chipp microarray 2009، يمكن الكشف بسهولة عن فيروس الإنفلونزا H one N one المستجد في عينة مسحة الأنف المأخوذة من طفل يعاني من مرض شبيه بالإنفلونزا.

بالإضافة إلى ذلك، فقد أثبتنا أن الشريحة الفيروسية قادرة على تحديد ليس فقط الفيروسات التنفسية، بل وأيضاً مجموعة واسعة من الفيروسات من أنسجة وسوائل جسمانية متنوعة. تظهر هنا بعض الأمثلة على الكشف عن الفيروسات في الدم الكامل والمصل باستخدام vichi. هذه هي المكالمات المقابلة لـ viro chip microray من عينات الدم، سواء كانت دماً كاملاً أو مصلاً تم سحبه من أربعة مرضى لكل عينة، حيث يتم عرض أعلى توقعين للفيروسات، بحيث يكون التوقع الفيروسي الأعلى هو الذي يمتلك أدنى قيمة P value.

على سبيل المثال، في العينة المظللة باللون الأزرق الفاتح، يكون التنبؤ الأول لتلك العينة هو فيروس حمى الضنك من النوع الأول. وبينما يأتي التنبؤ الثاني في الترتيب لفيروس حمى الضنك من النوع الثاني، فقد تأكد بالفعل أن الفيروس الموجود في عينة الدم الكاملة تلك هو فيروس حمى الضنك من النوع الأول، بما يتوافق مع نتائج الـ dict. وهناك تطبيق آخر لشريحة viro chip يتمثل في اكتشاف المسببات المرضية الجديدة.

تشمل بعض الأمثلة اكتشاف فيروس كورونا السارس X-M-R-V-A، والفيروس القهقري OME المرتبط بسرطان البروستاتا ومتلازمة التعب المزمن لدى البشر، وفيروس HTCV، وهو فيروس قلبي بشري جديد مرتبط بعدوى الجهاز التنفسي والإسهال لدى الأطفال. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 12 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر ضمان توافر جميع المعدات والكواشف اللازمة باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تضخيم PCR الفيروسي النوعي والتسلسل العميق من أجل تأكيد ومتابعة أنماط تهجين الرقاقة الفيروسية غير العادية أو نتائج الرقاقة الفيروسية التي تشير إلى وجود فيروس جديد. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأورام لاستكشاف ارتباط الفيروسات الجديدة بالسرطان، وفي مجالات الدفاع البيولوجي والأحياء الدقيقة السريرية لتطوير فحوصات تعتمد على المصفوفات الدقيقة المكثفة للتشخيص السريع لمسببات الأمراض، وفي مجال علم الفيروسات لتوصيف الفيروسات الجديدة وارتباطها بالأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ جميع خطوات مقايسة المصفوفة الدقيقة للرقاقة الفيروسية، وهي اختبار مراقبة واسع النطاق للكشف عن المسببات المرضية الفيروسية في العينات السريرية، بدءاً من استخلاص الحمض النووي من العينات السريرية وصولاً إلى تهجين المصفوفة الدقيقة وتحليلها.

لا تنسَ أن العمل مع العينات السريرية يُعد خطراً بيولوجياً، لذا يجب إجراء استخلاص الأحماض النووية في مختبرات مصنفة ضمن المستوى الثاني للسلامة البيولوجية أو أعلى.