اللوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في انواع معينة ايليجانس

يقوم هذا الإجراء بتطبيق القيد الغذائي على أطباق القياسية في sea elegance لدراسة تأثيره على طول العمر والتكاثر والتمثيل الغذائي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال قياس تركيز البكتيريا التي ستُستخدم كمصدر للغذاء بدقة. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي تخفيف مزرعة البكتيريا بشكل مناسب إلى تركيزات ملائمة.

بعد ذلك، قم بتحضير أطباق SDR قاعدية تحتوي على بكتيريا مقتولة. وأخيرًا، قم بإعداد تجارب SDR باستخدام مجموعة من الديدان متزامنة العمر. يمكن أن تظهر نتائج إنتاج النسل وقياسات طول العمر تأخراً وانخفاضاً في إنتاج النسل، بالإضافة إلى زيادة في متوسط طول العمر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق أخرى مثل طريقة Dian في وسط AZA، في أن التجربة بأكملها ستُجرى على طبق AGA صلب قياسي تستخدمه معظم مختبرات C. elegans لتجارب التقييد الغذائي. ولتحديد النتائج، يتم إنشاء منحنيات معايرة منفصلة لكل سلالة بكتيرية تُستخدم كمصدر غذائي. اختر مستعمرة واحدة من بكتيريا e coli OP 50 من مسحة حديثة على agar lb، وقم بتلقيح ثلاثة مللي لتر من وسط lb broth السائل في هزاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. ثم قم بتحضير تخفيفات تسلسلية مضاعفة (twofold dilution) للمستنبت الذي حُضر طوال الليل.

بعد ذلك، قم بقياس امتصاصية كل تخفيف عند 600 nanometers باستخدام جهاز spectrophotometer في ثلاث مكررات. ثم قم بتخفيف كل معلق بكتيري بمقدار مليون مرة، وازرع بالتساوي 0.4 milliliters من المعلق البكتيري لكل تخفيف على طبق lb agri بقطر 100 millimeter، واحضنها عند 37 °C لمدة تتراوح من 18 إلى 24 ساعة. قم بعدّ عدد المستعمرات البكتيرية النامية على كل طبق لحساب وحدات تكوين المستعمرات لكل milliliter لكل عينة.

الآن، قم برسم OD 600 كدالة في تركيز البكتيريا وأجرِ تحليل انحدار خطي لتحديد العلاقة بين قيم OD 600 المقاسة وتركيزات بكتيريا OP 50. بالنسبة لهذه الطريقة، يتم استخدام تركيز بكتيري قدره 1 × 10¹¹ CFUs لكل ملليلتر في حالة التغذية ad lido، و1 × 10⁸ CFU لكل ملليلتر كحالة تغذية DR المثالية. ومع ذلك، قد يلزم استخدام من أربعة إلى ستة تركيزات بكتيرية مختلفة لتحديد علاقة كاملة تعتمد على الجرعة.

من أجل SDR واستجاباته. قم بتحضير اللقاح باستخدام مستعمرة واحدة من بكتيريا e coli OP 50 في ثلاثة ملليلتر من مرق LB السائل، مع استزراعها في هزاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين ست إلى ثماني ساعات. انقل مستنبت OP 50 إلى دورق جديد يحتوي على 500 ملليلتر من مرق LB وقم بتنميته طوال الليل حتى تصل البكتيريا إلى مرحلة التشبع إذا لزم الأمر.

قم بتحضير التخفيف المناسب لمزرعة OP 50 لقياس الامتصاصية عند OD 600. ولتحديد تركيز البكتيريا، قم بترسيب البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 1500 Gs لمدة 20 دقيقة. تخلص من الراشح وأعد تعليق البكتيريا لتحقيق تركيز قدره 1 × 10¹² CFUs لكل ملليلتر.

الآن، قم بتحضير مستنبتات بكتيرية بحجم 10 milliliter بستة تركيزات مختلفة، تتراوح من 1 × 10¹² إلى 1 × 10⁷ CFU لكل milliliter باستخدام الماصة. انقل 0.2 milliliter من المستنبت البكتيري إلى مركز طبق N GM متصلب بقطر 60 millimeter. تجنب لمس سطح الطبق بطرف الماصة، حيث أن الخدوش الموجودة على السطح تسمح للديدان بالتغلغل في الطبقات الهوائية.

ضع الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف 10 µL من carbonic soin بتركيز 100 mg/mL و 10 µL من can mycin بتركيز 50 mg/mL إلى كل طبق لوقف نمو البكتيريا. تُحفظ الأطباق التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية التي قتلت البكتيريا عند درجة حرارة 4 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي لمدة تصل إلى شهر واحد.

من المهم تحضير وتخزين عدد كافٍ من الأطباق، ويفضل أن تكون من الدفعة ذاتها للنبات بأكمله. قم بإجراء التجربة قبل يوم أو يومين على الأقل للتحقق من حيوية البكتيريا. اكشط بعض البكتيريا من أطباق SDR وانشرها على طبق N GM فارغ يحتوي على carbonic وsein وantimycin.

ضع الطبق في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius لمدة تتراوح من ست إلى ثماني ساعات، وتأكد من عدم وجود نمو بكتيري. بالنسبة لمعظم الدراسات المتعلقة بـ SDR، مثل تحليل طول العمر وتوصيف إنتاج النسل، يعد تحضير مجموعة من الديدان المتزامنة في العمر أمراً أساسياً. استخدم ملتقط ديدان بلاتيني لنقل 20 إلى 30 دودة بالغة نشطة تكاثرياً إلى عدة أطباق NGM عادية.

مع سلالة OP 50. وبناءً على عدد البيوض المطلوبة للتجارب، قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من البالغين. تُترك الأطباق عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للسماح بوضع البيض.

قم بإزالة البالغين من الطبق وافحص الأطباق بصرياً للبحث عن البيض. استمر في تحضين الأطباق عند 20 درجة Celsius للسماح للنسل بالتطور إلى مرحلة L4 المتأخرة أو اليوم الأول من مرحلة البلوغ. عادةً ما يستغرق ذلك ثلاثة أيام لدودة N2 من النوع البري عند 20 درجة Celsius.

لتحليل مدى الحياة. انقِل 10 إلى 12 دودة بالغة في اليوم الأول إلى طبق SDR لبدء التقييد الغذائي. وللحصول على قوة إحصائية كافية، استخدم ما مجموعه 60 إلى 100 دودة لكل حالة SDR.

قم بتقييم حيوية كل دودة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان. ومن المهم نقل الديدان إلى أطباق SDR جديدة كل يومين لتجنب المجاعة. يمثل منحنى المعايرة هذا تركيز OP 50 بالنسبة إلى OD 600.

يمكن استخدام المعادلة الناتجة عن تحليل الانحدار الخطي لجميع الحسابات المستقبلية لتركيزات بكتيريا OP 50. تقيس هذه الدراسة تأثير علاجات SDR المزمنة على متوسط العمر الافتراضي لسلالات مختلفة من الديدان مقارنة بالاستجابة المعتمدة على الجرعة للديدان من النوع البري تجاه SDR. يتم تثبيط تأثير SDR على طول العمر جزئياً من خلال فرط تعبير DR two، بينما لا يوجد تأثير لطفرة DAF 16 MU 86 على إطالة العمر الناتجة عن SDR.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء Dian على اللعبة القياسية القائمة على AGA في sea elegance.