الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

يوضح هذا الفيديو طريقة لاستزراع وتوزيع سلالات فلورية من *C. elegans* من أجل الفحص عالي الإنتاجية للمكتبات الكيميائية أو الكشف عن الملوثات البيئية لتقييم تأثير العوامل الكيميائية أو البيئية على نشاط بروتين معين. في *C. elegans*، يتم أولاً تحضير المزارع البكتيرية كغذاء للديدان، ثم يتم استزراع ديدان متزامنة معدلة وراثياً ببروتين GFP.

يتم بعد ذلك جمع ما يتراوح بين 0.5 إلى 2 مليون دودة، وغسلها وتوزيعها على 3 أطباق معايرة دقيقة ذات 84 بئراً، ثم تُضاف إلى الديدان جزيئات صغيرة من مكتبة كيميائية أو عينات اختبار مثل الماء أو الغذاء أو التربة. وفي النهاية، يتم قياس فلورية الديدان باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.

يكشف تحليل البيانات لشدة الفلورة عن جزيئات صغيرة تعمل على تعديل مسارات النسخ القابلة للاستحثاث أو تسمح بالكشف عن الملوثات البيئية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المقايسات القائمة على المختبر أو المزارع الخلوية، في عدم إضاعة الوقت على المركبات السامة أو غير النشطة داخل الجسم الحي. ويمكن لهذه الطريقة عالية الإنتاجية أن تساعد في تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعدل مسارات استحثاثية متنوعة.

على الرغم من أننا طورنا هذه الطريقة للفحص عالي الإنتاجية لمكتبات الجزيئات الصغيرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في الاستشعار الحيوي للملوثات في العينات الغذائية والبيئية. سيقوم بتوضيح الإجراء كل من Andrew Dine، وهو فني في مختبري، و Q long، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. قم بتحضير غذاء الديدان البكتيرية مسبقاً.

ابدأ بتلقيح 500 milliliters من مرق terrific، المكمل بـ 50 micrograms per milliliter من streptomycin، باستخدام خمس milliliters من e coli. OP 50 المشبعة. ضع المزرعة على جهاز هزاز واتركها تنمو طوال الليل عند 37 degrees Celsius.

في اليوم التالي، قم بتقسيم المزرعة إلى 10 أنابيب سعة 50 milliliter. ثم ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي مبرد وقم بتدويرها بسرعة 2, 500 RCF لمدة 20 دقيقة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإعادة تعليق كل كتلة بكتيرية في 10 milliliters من وسط نمو النيماتودا السائل أو NGM.

رُجّ المعلقات أفقيًا باستخدام جهاز رج أرضي لمدة 15 minutes لإعادة تعليق البكتيريا. بعد ذلك، قم بطرد المزرعة البكتيرية مركزياً عند 2, 500 RCF في درجة حرارة 4 °C لمدة 20 minutes.

قم بصب وسط NGM وفصل السائل، ثم زن الراسب البكتيري. بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من منظم NGM وأعد تعليق الرواسب باستخدام جهاز الرج (vortex). وأخيراً، وزع ثلاث ملي لتر من المزرعة البكتيرية المعاد تعليقها في أنابيب سعة 15 ملي لتر، واحفظها في درجة حرارة -20 °C حتى وقت الحاجة إليها.

في هذا العرض التوضيحي، سيتم قياس تأثير إجهاد Xeno Duke loan على عامل النسخ Sskn one كمثال. ومن المعروف أن Sskn one ينشط الجينات الواقية للخلايا أثناء الإجهاد التأكسدي وإجهاد المواد الغريبة. يتم تحضير مزرعة واسعة النطاق من سلالة Trenchgenic c gans VP 5 96، والتي تحمل بنيتين فلوريتين.

تعبّر ديدان VP 5 96 عن كل من محفز GST four الذي يحرك GFP، والذي يُستخدم لمراقبة نشاط عامل النسخ Sskn one، ومحفز DOP three الذي يحرك RFP، والذي يُستخدم كمعيار لتقييس عدد الديدان.

يُعد DOP three المُحفز لمستقبل الدوبامين، ويتم التعبير عنه بشكل بنيوي في الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجسم. في هذا المثال، ونظراً لأن xenobi lon ينشط sskn one بقوة ويزيد من كمية GFP المُعبر عنها من المُحفز GS T four، ولتحضير المزارع، ابدأ بخلط 150 milliliters من محلول N NGM المنظم، و1.5 milliliters من LB و150 microliters من الكوليسترول بتركيز 1 molar و75 microliters من Streptomycin بتركيز 100 milligrams per milliliter. تساعد إضافة LB في منع التصاق الديدان بالأدوات الزجاجية والبلاستيكية، ولكن هذه الكمية غير كافية لدعم النمو البكتيري.

قم بترشيح الخليط لتعقيمه، ثم انقله إلى دورق معقم سعة لتر واحد واتركه جانبًا لتحرير البيض من ديدان GR البالغة. اغسل البكتيريا من الديدان عن طريق طردها مركزياً واستبدال وسط NGM حتى يصبح الراشح صافياً. اغسل الديدان مرة ثانية عن طريق إعادة تعليقها في ماء معقم ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى بعد عملية التدوير.

أزل المادة الطافية واملأ الأنبوب بـ 3.75 milliliters من الماء المعقم. أضف 1 milliliter من مبيض الملابس المنزلي و 250 microliters من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 10 normal، واخلطهما فوراً عن طريق قلب الأنبوب من خمس إلى ست مرات. ضع الأنبوب في جهاز تدوير (rotator) بعد تعريض الديدان للمبيض لمدة أربع دقائق.

ضع الأنبوب تحت مجهر ستيريو. يجب أن تكون معظم الديدان البالغة قد تحللت. رج الأنبوب بقوة من 15 إلى 20 مرة للمساعدة في تحلل أي ديدان بالغة متبقية، وبعد مرور خمس دقائق إجمالاً، أضف ماءً معقماً حتى يمتلئ الأنبوب.

اخلط عن طريق القلب من خمس إلى ست مرات لجمع البويضات. ثم قم بطرد مركزي للأنبوب لمدة دقيقة واحدة عند 500 RCF. اغسل البويضات ثلاث مرات عن طريق إعادة التعليق، حيث يتم تدويرها في 10 milliliters من الماء المعقم، ثم الطرد المركزي وإزالة الطافي.

بعد ذلك، قم بتخفيف عينة بحجم 100 µL من البيض بمقدار 100 ضعف عن طريق إضافة 10 mL من محلول NGM المنظم. ثم انقل ثلاث حصص بحجم 5 µL لكل منها إلى غطاء طبق بتري تحت المجهر. قم بعدّ عدد البيض في الحصص الثلاث المنفصلة التي يبلغ حجم كل منها 5 µL.

لتقدير العدد الإجمالي للبويضات، أضف من 200,000 إلى 2 مليون بيضة إلى الدورق الذي يحتوي على NGM buffer، ورج المزرعة بسرعة 100 RPM عند درجة حرارة 20 °C. وبعد مرور 16 ساعة على الأقل من إضافة البويضات إلى الدورق، استخدم ماصة سيرولوجية معقمة لسحب 0.5 milliliters تقريباً من مزرعة الديدان المعلقة.

استخدم الماصة لوضع ثلاث قطرات بحجم 5 µL على الغطاء المعقم لطبق بتري. ضع الغطاء في مجمد عند درجة حرارة -20 °C لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين لشل حركة الديدان. وبمجرد شل حركتها، قم بعدّ متوسط عدد الديدان الحية التي فقست لكل 5 µL باستخدام مجهر ستيريو لتقدير العدد الإجمالي.

قم بإذابة المزرعة البكتيرية المجمدة من سلالة OP 50 التي تم تحضيرها مسبقاً عن طريق وضعها على طاولة المختبر لبضع دقائق. بعد ذلك، أضف ثلاثة milliliters من OP 50 بتركيز 50% لكل 500,000 دودة فقست. قم برج القارورة بسرعة 100 RPM عند درجة حرارة 20 °C.

ستتطور الديدان إلى يرقات من المرحلة الرابعة L4 ومراحل البلوغ المبكرة في غضون 51 ساعة تقريبًا. راقب كمية البكتيريا طوال فترة الحضانة عن طريق الفحص البصري. أضف المزيد من البكتيريا إذا أصبح الوسط شفافًا.

استخدم ماصة سيرولوجية معقمة لنقل حوالي 0.5 milliliters من مستنبت الديدان العالق إلى طبق آغار NGM قياسي. افحص الديدان باستخدام مجهر ستيريو للتأكد من أن معظمها في مرحلة اليرقات L four وبالغين شباب؛ حيث ستظهر اليرقات L four تحت مجهر المجال المضيء بوجود بقعة شفافة بطنية في منتصف الجسم، بينما يكون البالغون الشباب أكبر قليلاً ولا تظهر لديهم هذه البقعة الشفافة.

بعد ذلك، اسحب مستنبت الديدان إلى أنابيب معقمة سعة 50 milliliter. ضع الأنابيب في حامل أنابيب اختبار داخل خزانة التدفق الصفحي، واتركها حتى تترسب البيوض غير المفقسة أو الديدان التي لم تتطور؛ حيث تترسب هذه العناصر بشكل أبطأ من الديدان المتطورة.

بعد 10 دقائق، قم بإزالة السائل الطافي الذي يحتوي على الديدان غير الفقسة وغير المتطورة عن طريق الشفط، ثم أضف حوالي 10 milliliters من منظم NGM إلى كل راسب وقم بتعليق الديدان عن طريق تدوير الأنابيب برفق. اجمع كل الديدان في أنبوب واحد سعة 50 milliliter. قم بالتدوير في جهاز طرد مركزي ذو دلاء متأرجحة عند 500 RCF لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك، أعد تعليق الديدان في 50 milliliters من NGM مع 1%lb لغسلها. كرر هذه العملية، واغسلها من ثلاث إلى أربع مرات لإزالة البكتيريا بعد الغسل. املأ الأنبوب بـ NGM بالإضافة إلى LB buffer حتى 50 milliliters.

صب هذا المزيج في دورق مخصص لتوزيع الديدان يحتوي على قضيب تقليب، ثم ضعه على لوح تقليب. يلزم وجود 20 milliliters أو 60,000 دودة كحد أدنى لملء المساحة الميتة في دورق التوزيع وكاسيت الموزع. قم بعدّ عدد الديدان في ثلاث قطرات بحجم five microliter كما تم توضيحه مسبقاً.

بعد العد في وسط NGM مضافاً إليه LB للوصول إلى تركيز يتراوح بين 12 إلى 15 دودة في كل قطرة بحجم 5 µL، يتطلب كل طبق 384 بئراً حوالي 35,000 دودة أو 11.5 mL من الديدان المعلقة. قم بتركيب كاسيت توزيع سعة 10 µL في الموزع وعقمه عن طريق التطهير باستخدام ethanol بتركيز 70%. اغسل الـ ethanol عن طريق التطهير باستخدام ماء معقم.

أدخل طرف خرطوشة التوزيع في الدورق بحيث تكون فوق قضيب التحريك مباشرة دون إعاقة حركته. تأكد من بقاء الديدان معلقة في جميع أنحاء الدورق. قم ببرمجة جهاز التوزيع لتوزيع الديدان بسرعة منخفضة مع نبضتين تمهيديتين (pre pulses) لتهيئة الجهاز وتشغيله، مع توزيع 10 milliliters على الأقل من الديدان المعلقة.

املأ ألواح المعايرة الدقيقة، التي يجب أن تحتوي بالفعل على المركبات المختبرة، بسرعة لمنع الديدان من الترسب في الأنابيب. في هذه المرحلة، يتم استخدام المركب المختبري الذي تم تحميله مسبقاً على لوح المعايرة الدقيقة. Glow. قم بإغلاق الألواح بشريط لاصق نفاذ للهواء لمنع تجمع الغبار في الآبار.

ضع الأطباق على منصة هزازة داخل حاضنة في درجة الحرارة المناسبة للمقايسة. لا تضع الأطباق فوق بعضها البعض لأن ذلك قد يعيق تدفق الهواء. ضع الطبق المستهدف في قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) لقياس شدة الفلورة لكل بئر باستخدام أطوال موجات الانبعاث والاستثارة المناسبة.

تكون المرشحات المستخدمة لـ GFP عند طول موجي للإثارة يبلغ 485 وللانبعاث 528. أما المرشحات الخاصة بـ RFP فتكون عند طول موجي للإثارة يبلغ 540 وللانبعاث 590. بعد قراءة الطبق، احسب نسبة GFP إلى RFP وقم بتطبيعها (normalization) باستخدام قراءات آبار التحكم، التي لا تحتوي على المركب المنشط، وذلك لتحديد مقدار الفرق الدقيق في شدة الفلورة الناتجة عن المعالجات الفردية.

يستخدم مقايسة SSKN one الموضحة هنا تقريراً مزدوجاً مدمجاً في الكروموسوم، وهي سلالة تم فيها عد الديدان يدوياً باستخدام مجهر ستيريو. ارتبط عدد الديدان بالحجم الذي تم توزيعه بقيمة R squared بلغت 0.94 وقيمة p أقل من 0.0001. ويشير هذا إلى أنه يمكن التحكم في عدد الديدان الموزعة في كل بئر عن طريق ضبط الحجم الموزع.

إن إجمالي فلورة GFP لكل بئر الموضح على اليسار وفلورة RFP لكل بئر الموضحة على اليمين قابلة للتكرار بدرجة عالية من بئر إلى آخر عبر لوحة تحتوي على 384 بئراً في هذه الأشكال. تشير XS إلى الفلورة النسبية المقاسة في كل بئر. تشير الخطوط المتصلة إلى المتوسطات، بينما تشير الخطوط المتقطعة إلى ثلاثة انحرافات معيارية فوق أو تحت متوسط الفلورة لجميع الآبار، حيث كان معامل التباين أقل من 9%. وكما هو موضح في هذا الشكل، فإن فلورة GFP من محفز GST four ترتبط خطياً بفلورة RFP من محفز DOP three عبر 384 بئراً، بقيمة R squared تبلغ 0.62 وقيمة p أقل من 0.0001.

وبناءً على ذلك، يمكن استخدام مراسل RFP غير القابل للتحفيز لمعايرة مراسل GFP القابل للتحفيز. وعندما يتم التعبير عنهما، تصبح نسبة فلورة GFP إلى RFP قابلة للتكرار بدرجة عالية من بئر إلى آخر عبر لوحة ذات 384 بئراً.

أدى حساب نسبة GFP إلى RFP إلى خفض معامل التباين إلى أقل من 6%، مما يثبت قدرة مراسل RFP ذو المروج الثلاثي DOP على تقليل التباين كما هو موضح هنا. إن تحفيز GFP بالنسبة إلى RFP باستخدام مادة xeno biotic منشطة لـ SK N one هو تحفيز قوي وقابل للتكرار بدرجة عالية عبر لوح 384 well plate، حيث تم تمييز متوسطات نسب الفلورة النسبية لجميع آبار التحكم وآبار due GLO بخطوط متصلة. كما تم تمييز ثلاثة انحرافات معيارية فوق متوسط التحكم وتحت متوسط dlo بخطوط متقطعة.

بمجرد إتقان الطريقة، يمكن بدء استزراع الديدان في غضون ساعة واحدة تقريباً في اليوم الأول، بينما تستغرق عملية الجمع والتوزيع حوالي ساعتين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر البدء بـ 60,000 دودة على الأقل والحفاظ على تعليقها أثناء التوزيع؛ وباتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء عمليات فحص لأخرى، على سبيل المثال، تقارير السلاسل لمسارات تحريضية أخرى، وذلك من أجل تطوير معدلات لمسارات أخرى بعد تطويرها.

يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجالات الفحص عالي الإنتاجية والاستشعار الحيوي لتحديد معدلات المسارات للجزيئات الصغيرة بسرعة أو الكشف عن الملوثات البيئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع وتوزيع وقياس سلالات *elegant* الفلورية للفحص عالي الإنتاجية للمسارات النسخية القابلة للاستحثاث أو اختبار عينات متعددة للكشف عن الملوثات البيئية.