تحضير وتنقية وتوصيف انثانيد المجمعات للاستخدام وكلاء والتباين للتصوير بالرنين المغناطيسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تخليق وتنقية وتوصيف معقدات تحتوي على اللانثانيدات يمكن استخدامها لوسم الجزيئات البيولوجية الكبيرة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق خلط المادة المعدنية الأولية والربيطة مع التحكم في الرقم الهيدروجيني pH للمحلول. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تنقية المعقد الناتج باستخدام الديلزة.

بعد ذلك، يجب التحقق من عدم وجود معادن حرة. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في توصيف خصائص المعقد ذات الصلة بالتصوير. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تبين أن المعقدات المُصنّعة ستعمل كعوامل تباين من خلال قياسات نشاط الاسترخاء.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التصوير، مثل ما إذا كان عدد تنسيق المياه لعامل التباين يتغير عند الارتباط ببروتين ما. وبوجه عام، سيواجه الأشخاص الذين يحتاجون إلى هذه الطريقة صعوبة لأن التحكم الدقيق في pH سيؤدي إلى جعل LI غير مفيد للتعليم الحيوي. وسيتولى Buda وSashi توضيح عمليات الديلزة وقياسات النشاط.

يبدأ طلاب الدراسات العليا في مختبري عملية الميثلة (methation) باستخدام أملاح اللانثانيدات عن طريق إذابة مكافئ واحد من الربيطة (ligand) في الماء لتحضير محلول يتراوح تركيزه بين 30 و265 millimolar. تُستخدم الربيطة Paraiso Benzyl DTPA هنا بتركيز 73 Millimolar. بعد ذلك، يتم ضبط الرقم الهيدروجيني (pH) لمحلول الربيطة ليكون بين 5.5 و7 عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز واحد molar.

في هذا الفيديو، يتم استخدام 0.2 ملليلتر من محلول هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز واحد مولار لإذابة مكافئ واحد إلى مكافئين من كلوريد اللانثانيد في الماء لإنتاج محلول بتركيز يتراوح من 5 إلى 1000 ميلي مولار. ويمكن استخدام إما كلوريد الأوروبيوم أو كلوريد الجادولينيوم بتركيزات تبلغ 111 ميلي مولار. وغالبًا ما يُستخدم فائض من المعدن لدفع عملية التهوية حتى الاكتمال، وبالتالي تبسيط عملية التنقية.

بعد ذلك، أضف كل محلول من أملاح اللانثانوم إلى محلول الليجاند المُحضّر مع التقليب. الآن، اضبط قيمة pH لخليط التفاعل الناتج لتصبح بين 5.5 و 7 عن طريق إضافة هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 0.2 molar. وهنا، يُستخدم إجمالي 0.5 milliliters من محلول هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 0.2 molar لضبط المحلول.

إذا كان الليجاند المستخدم يحتوي على مجموعات وظيفية حساسة للأحماض، فقم بتعديل قيمة pH عدة مرات خلال هذه الخطوة. يجب توخي الحذر عند تعديل pH لأنه في حال أصبح المحلول قاعديًا للغاية، فإن أي مجموعات وظيفية حساسة للقواعد مثل Isothiocyanate ستصبح غير صالحة للاستخدام. ولإتمام عملية الاقتران، راقب التفاعل بدقة عن طريق قياسات pH.

يكتمل التفاعل عندما يظل pH ثابتاً. بالنسبة للربيطات التي لا تحتوي على أي مجموعات وظيفية حساسة للقواعد، قد يكون إجراء المعالجة الذي يتضمن رفع قيمة pH مفيداً أيضاً. لبدء عملية المعالجة بالديلزة، حدد الطول المناسب لأنبوب الديلزة لاستيعاب حجم العينة بالإضافة إلى طول إضافي لاستيعاب 10% إضافية من حجم العينة. ثم اتبع إرشادات الشركة المصنعة لقص الأنبوب بهذا الطول.

في هذا الفيديو، تم استخدام غشاء بقطع وزن جزيئي يتراوح من 100 إلى 500 دالتون، ولكن يمكن استخدام أنابيب بقطع وزن جزيئي أكبر حسبما يقتضي الأمر إذا تم إجراء الاقتران قبل عملية الميثة. وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة، انقع أنبوب الدياليز المقطوع في الماء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، املأ خزان الدياليز بالماء، والذي سيعمل كمحلول دياليز. تم استخدام بيكر سعة لتر واحد هنا.

يجب أن يكون حجم سائل الديلزة حوالي 100 ضعف حجم العينة. الآن، قم بطي أحد طرفي الأنبوب مرتين وثبّت الجزء المطوي باستخدام مشبك إغلاق الديلزة. لف طرف الإغلاق برباط مطاطي لضمان بقائه مغلقاً أثناء عملية الديلزة.

قم بترشيح خليط التفاعل الذي تم تحضيره مسبقاً باستخدام مرشح بمسامية 0.2 micron. ثم قم بتحميل الرشاحة في الطرف المفتوح من الأنبوب، مع الحرص على عدم تمزيق الأنبوب.

تأكد من ترك مساحة كافية في الأعلى لإغلاق الأنبوب. اطوِ الطرف المفتوح المتبقي من الأنبوب مرتين، ثم أحكم إغلاقه باستخدام سدادة ولف السدادة بشريط مطاطي. بعد ذلك، قم بتثبيت قارورة زجاجية تحتوي على هواء بالمشبك الموجود على أحد طرفي أنبوب الدياليز باستخدام شريط مطاطي آخر.

ثم قم بتثبيت قنينة تحتوي على الرمل في المشبك الآخر. تضمن هذه القناني بقاء الأنابيب مغمورة في السائل الدياليزي. الآن، ضع الأنابيب الممتلئة في خزان الدياليز الذي يحتوي على السائل الدياليزي.

قم بتحريك محلول الديالزة باستخدام لوح تحريك مغناطيسي بسرعة منخفضة في درجة الحرارة المحيطة. تأكد من بقاء سرعة التحريك منخفضة وعدم تعريض المحلول لعملية Vortex. قم بتغيير محلول الديالزة ثلاث مرات على مدار اليوم.

في هذا الفيديو، يتم تغيير سائل الديلزة عند الساعة 2.5 و6.5 و11.5. اترك عملية الديلزة مستمرة طوال الليل لمدة إجمالية تتراوح بين 20 و28 ساعة. وبمجرد اكتمال الديلزة، قم بإزالة الأنابيب من سائل الديلزة وافتح أحد السدادات بعناية لإخراج العينة.

اغسل أنابيب الديلزة ثلاث مرات بالماء واجمع مياه الغسيل مع العينة. وأخيراً، قم بإزالة الماء من العينة تحت ضغط منخفض هنا، ويتم تحقيق ذلك عن طريق التجفيف بالتجميد.

يتم تجميد العينة ثم وضعها في جهاز التجفيف بالتجميد. ولتقييم وجود المعادن الحرة في العينة، يتم أولاً تحضير محلول خلات منظم عن طريق إذابة 1.4 milliliters من حمض الخليك في 400 milliliters من الماء، وضبط pH إلى 5.8 باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز واحد molar، ثم إضافة الماء للوصول إلى حجم إجمالي قدره 500 milliliters. بعد ذلك، تُذاب 0.3 milligrams من كل معقد في 0.3 milliliters من المحلول المنظم.

قم الآن بتحضير كاشف xol orange، بحيث يكون تركيزه 16 micromolar في منظم pH 5.8. أضف ثلاثة milliliters من محلول الكاشف هذا إلى المعقدات المعدنية التي تم إذابتها مسبقاً. اكشف عن وجود المعدن الحر من خلال ملاحظة تغير لون الكاشف من الأصفر إلى البنفسجي.

إذا رغبنا في ذلك، يمكن تحديد كمية المعدن الحر كمياً عن طريق إنشاء منحنى معايرة. وفي حال بقاء معدن حر، يجب تنقية العينة بشكل إضافي باستخدام الديلزة أو كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء قبل إجراء التوصيف. بعد ذلك، ولتحديد عدد التناسق المائي لعينة من الأفيون، قم بتحضير محلول بتركيز حوالي 1 millimolar من المعقد المحتوي على الأفيون في الماء، ثم حضر محلولاً آخر بنفس التركيز في أكسيد الدوتيريوم.

قبل البدء في التحليل، يجب تبخير محلول أكسيد الديوتيريوم وإذابته في أكسيد الديوتيريوم ثلاث مرات لإزالة الماء المتبقي، ثم قم بتشغيل جهاز مقياس الطيف الفلوري، وأضف المحلول المائي إلى كوفت (vete) نظيفة وضع الكوفت في جهاز مقياس الطيف الفلوري. الآن، قم بإجراء عمليات الإثارة والانبعاث لتحديد القيم القصوى لكل منهما عند 395 nanometers و 595 nanometers تقريباً على التوالي. بعد ذلك، قم بإجراء تجربة اضمحلال زمن الفسفرة باستخدام أطوال موجات الإثارة والانبعاث التي تم تحديدها للتو والمعلمات المعروضة هنا.

كرر هذه الخطوة باستخدام محلول أكسيد الديوتيريوم المحضر؛ ومن بيانات اضمحلال اللمعان التي تم الحصول عليها للتو، ارسم العلاقة بين اللوغاريتم الطبيعي للشدة مقابل الزمن. يمثل ميل هذه الخطوط معدلات الاضمحلال. في هذا الفيديو، تم استخدام برنامج Microsoft Excel 2007 لإنشاء مخططات اللوغاريتم الطبيعي من البيانات الأولية.

استخدم معدلات الاضمحلال الواردة في المعادلة التي طورها hors وزملاؤه والموضحة هنا. إذا كان الليجاند يحتوي على مجموعات OH أو NH مرتبطة بالمعدن، فيجب تعديل المعادلة قبل الاستخدام. ولتحديد قياسات النسبية للعينة، اختر أولاً وضع التطبيق المطلوب في محلل زمن الاسترخاء، إما T one أو T two.

يتم هنا اختيار إعداد T one. بعد ذلك، قم بتحضير سلسلة من العينات التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المعقد المحتوي على اللانثانيدات في مذيب مائي. هنا، يُستخدم الماء كمذيب، وتكون المحاليل بتركيزات 5، 2، 0.5، 1.25، 0.625 وصفر.

يتم تحضير المحاليل بتركيز ملي مولار. يمكن استخدام مذيبات أو محاليل منظمة أخرى متوافقة، ولكن من المهم استخدام المذيب كعينة فارغة (blank). يعتمد الحجم النهائي للعينة على الجهاز المستخدم.

ضع العينة في الجهاز واتركها لمدة خمس دقائق لتتوازن مع درجة حرارة الجهاز، والتي تبلغ 37 °C في الوحدة المستخدمة في هذا الفيديو. حدد الآن زمن الاسترخاء بوحدات الثواني عن طريق ضبط بارامترات البرنامج للحصول على منحنى أسي سلس لـ T1 أو T2. كرر هذه العملية لجميع العينات، بما في ذلك العينة الضابطة (blank).

الآن، احسب مقلوب قيم زمن الاسترخاء T one أو T two المقاسة وقم برسمها. يتم رسم هذه القيم مقابل تركيز اللانثانوم بوحدات millimolar، ثم يتم ملاءمة المخطط بخط مستقيم. يمثل ميل الخط الملاءم نشاط الاسترخاء، والذي يكون R one أو R two لكل من T one و T two على التوالي.

نرى هنا المخطط العام لعمليتي الوساطة والتنقية. يوضح هذا المخطط الإجراء العام للوساطة وأسباب اختيار مسارات تنقية مختلفة. نرى هنا مخططاً تمثيلياً لاضمحلال اللومينيسنس، حيث يتم رسم اللوغاريتم الطبيعي للاضمحلال مقابل الزمن؛ وتُستخدم منحدرات الخطوط الناتجة من منحنيات مماثلة للمحاليل المائية ومحاليل أكسيد الديو تيريوم مع المعادلة رقم 1 لتحديد عدد تناسق الماء في المعقدات التي تحتوي على الأوبيم.

يمكن رؤية مثال نموذجي لقياسات الليفيتي (livity) هنا، حيث يمثل ميل الخط المجهز ليفيتي T1 للعينة. وبالإضافة إلى عدد تناسق المياه وتوصيف الليفيتي الموضحين في البروتوكول، فمن المهم أيضاً توصيف المنتجات النهائية باستخدام تقنيات كيميائية قياسية. يمكن تحديد هوية المركب باستخدام مطيافية الكتلة، وتظهر هنا أطياف كتلة نموذجية توضح أنماط النظائر التشخيصية للمعقدات التي تحتوي على الجادولينيوم والأوبيوم.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل مطيافية endr وHPLC والتحليل العنصري لمزيد من التوصيف للمعقدات الناتجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تخليق وتنقية وتوصيف المعقدات التي تحتوي على لانثانيدات والتي يمكن استخدامها لوسم الجزيئات البيولوجية الكبيرة.